基因芯片 第三章 基因芯片的制作方法.ppt

第三章 基因芯片的制作方法,3.1 概述,1. 基因芯片是以Southern印迹杂交技术为基础 发展起来的反向杂交技术,,2. 基因芯片的制作方法：原位合成法：Affymetrix公司直接点样法（合成后点样）：Stanford大学，1995年,,1. 常见的载体类型膜玻片三维基质包被玻片,3.2 芯片载体的制作,,（1）膜优点：与核酸亲和力强缺点：单位面积上点样密度低；背景较高；灵敏度低2）玻片优点：耐受高温和高离子强度；具有不浸润性，提高点样密度；背景低缺点：二维的平面结构，与DNA杂交时会有空间位阻3）三维基质包被玻片具有三维孔性结构，更适合做蛋白质芯片的支持物，可以保持蛋白质的空间构象，不影响它的活性表1 基因芯片不同载体性能对比,,2. 探针分子与基片表面的作用方式化学偶联：探针分子与基片表面活性基团发生化学 反应，生成新的共价键物理吸附：探针分子与基片表面通过次级键相连接3. 玻片的修饰类型 氨基修饰玻片 同型双功能偶联剂修饰的玻片 硫醇基修饰的玻片 环氧硅烷化修饰的玻片等,,图3-3 APS修饰玻璃表面反应示意,（1）氨基修饰的玻片,,羟基,,,氨基,对苯乙异硫氰酸,（2）同型双功能偶联剂包被修饰的玻片,,异硫氰基,,,,,醛基,戊二醛,,,图3-6 寡核苷酸探针固定在PDC基片上的原理,,连接分子,,手臂分子,,特异性探针,,图3-7 SMPB连接硫醇基核苷酸和氨基玻片,（3）连接硫醇基修饰的玻片,,硫醇基,图3-8 环氧硅烷化玻片修饰示意,（4）环氧硅烷化修饰的玻片,,环氧硅烷基,,图3-9 在硅烷化玻片上生成树形连接分子系统的示意,（5）聚酰胺树形连接分子系统修饰的玻片,1. cDNA探针 2. 寡核苷酸探针 3. 基因组DNA探针（很少用）,3.3 探针的制备,,cDNA探针：主要来自cDNA文库，从细胞或组织中提取RNA后逆转。

寡核苷酸探针：根据数据库中的基因序列人工合成的通常在5’末端进行氨基修饰，并加入一段不直接参与杂交的重复序列，称为手臂分子，通常用poly dT(10)手臂分子,,特异性探针,表2 寡核苷酸与cDNA 对比,3.4 点样仪及点样过程,接触式点样非接触式点样,,1. 接触式点样点样针基本过程：点样针接触探针溶液，通过浸润现象或毛细现象，使液体转移到针尖或针的狭缝中针尖再接触基片，样品在基片上留下斑点，完成一次点样点样针的种类：实心针（solid pin）裂隙针（split pin）毛细管针（capillary tube）针与环（pin and ring）,,best,图3-13 Amersham公司的Molecular Dynamics GenerationⅢ Array 点样仪及毛细管点样针,,2.非接触式点样（自学）（1）微螺线阀（2）压电元件,,Cartesian - PixSys Series,,接触式,非接触式,图3-2 当前59家芯片设备生产商使用的点样针分布情况 （图中的数字代表使用各点样针的厂家数目）,3.5 原位合成法,操作平台,,Affymetrix芯片的特点：光导原位合成的寡核苷酸芯片高密度的点阵技术独特的PM-MM探针设计,1.光导原位合成原理,,2.高密度的点阵技术,1个平方厘米的面积至少可排列几十万到一百多万个 探针合成区（“点”）,3. Affymetrix独特的PM-MM探针设计,,,,,,图3-24 PM-MM探针设计方案,,,,,高灵敏度,图3-26 仅用PM探针与联合应用PM-MM 探针检测靶序列的灵敏度比较,,特异性和灵敏度的提高 MM探针的作用： 内参 提高特异性 背景信号 提高灵敏度,芯片结果准确可靠,图3-25 PM-MM的多个探针的结果与单个探针的结果比较,,,,,,,,,图3-27 Affymetrix芯片的重复性实验（信号值的散点图）,,,4. 光导原位合成法的缺点,需要避光掩膜，造价高； 光脱保护方式，造成光衍射，制约探针密度的提高 对研究者而言，每次实验只是使用芯片探针的一部分，探针浪费严重,。