实验三、食品中蜡样芽孢杆菌的检验.ppt

为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定 蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的检验 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定 （一）蜡样芽胞杆菌生物学性状 1、形态和染色特性 该菌为革兰氏阳性的大杆菌，菌体两端较平整，芽 胞呈椭圆形，位于菌体中央稍偏一端,多呈链状排列, 无荚膜，有周鞭毛 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定 2、培养特性 （1）需氧菌，生长温度范围在10-45℃之间最适 生长温度为28-35℃ （2）在普通培养基上生长良好 本菌在普通琼脂平板上，生 长的菌落呈乳白色，不透明， 直径4-6mm,边缘不整齐，表面 粗糙，呈毛玻璃状或白蜡状 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定。

（3）在血液琼脂平板上形成 浅灰色、不透明、似毛玻璃 状的菌落菌落周围初呈草 绿色溶血,时间稍长即完全透 明 （4）蜡状芽胞杆菌在甘露醇 卵黄多粘菌素琼脂(MYP) 上的菌落为粉红色(表示不发 酵甘露醇)，周围有粉红色的 晕（表示产生卵磷脂酶） 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定 （5）在普通肉汤内生长迅速，肉汤混浊，常 常有菌膜或壁环，振摇易乳化 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定 3、生化性状： （1）葡萄糖发酵试验：接种于酚红葡萄糖肉汤中， 厌氧条件下35℃培养24h培养基应由红色变 为黄色 （2）硝酸盐还原试验：阳性（红色） （表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸） （3） V-P试验：接种于改良V-P培养基中，35℃ 培养48 h加V-P试剂及肌酸数粒，静止 1h，应为阳性反应（伊红色） 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定。

（4）L-酪氨酸分解试验：接种于L-酪氨酸琼脂培 养基上，35℃培养48 h,阳性反应菌落周围培 养基应出现澄清透明区（表示产生酪蛋白 酶）阴性时应继续培养72 h再观察 （5）溶菌酶试验：用直径2mm接种环取纯菌悬液 一环,接种于溶菌酶肉汤中，35℃培养24h 该菌在本培养基（含0.001％的溶菌酶）中能 生长如出现阴性反应,应继续培养24 h 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定 4、致病性 蜡样芽胞杆菌引起食物中毒，除必须具有大量的细菌 外，肠毒素也是重要的致病因素 耐热性肠毒素：100℃30分钟不能被破坏，为引起呕吐 型中毒的致病因素,常在米饭中形成 不耐热肠毒素：是引起腹泻型胃肠炎的病因，能在各种 食物中形成 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定 5、抵抗力 蜡样芽胞杆菌100 ℃ 20分钟即可被杀死；对酸 碱不敏感，pH6-11对本菌基本上不受影响，pH5以 下，生长可受到抑制。

为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定 （二）流行病学特点 1、季节性特点： 以夏、秋季，尤其是6～10月为多见 2、食品种类 －剩饭，特别是大米饭 －乳及乳制品、畜禽肉类制品、蔬菜、莱汤、马铃薯、 豆芽、甜点心、调味汁、色拉 国内：与淀粉质食品相关多 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定 3、临床症状 呕吐型中毒：多见于过剩米饭和油炒饭，由耐热性 肠毒素为致病因素；潜伏期短，一般为2～3小时，最短 为30分钟，最长5～6小时；症状以呕吐，腹痉挛为主， 腹泻则少见，一般经过8～10小时而治愈 腹泻型中毒：由各种食品中不耐热肠毒素引起，潜 伏期在6小时以上，一般为6～14小时；症状以腹泻，腹 痉挛，而呕吐却不常见；病程24～36小时 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定。

1.蜡样芽孢杆菌检验程序 ： 检样 25g(ml)+225ml生理盐水 中华人民共和国国家 标准食品卫生微生物 学检验蜡样芽孢杆菌 检验GB/T 4789.28- 2003 做成10-1-10-5的稀释液 选择性培养基（菌数测定） MYP 选择性培养基（分离培养） MYP 37℃，18h-24h 菌数计算营养琼脂培养基 36 ℃ ±1℃12h~20h36 ℃ ±1℃12h~20h 生长及菌落观察染色镜检生化试验菌株保存 报 告 （三）检测方法 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定 10-1~10-5的 稀释液的制备 每个稀释度 0.1mL接种于2个 MYP培养基 36±1℃ 12~20h 菌落计数 36±1℃ 12~20h 挑取菌落接种肉汤和营养琼脂培养基（分离培养） 证实试验 报 告 形态观察 染色镜检 培养特性 生化特性 生化分型 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定。

2．菌数测定 • 以无菌操作将检样25g或25 ml按菌落总数测定方式，用 灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成10-1～10-5的稀释液 取各稀释液0.1ml，接种在选择培养基（甘露醇卵黄多黏 菌素琼脂）平板上，用L形棒涂布于整个表面，置37℃培 养12～20h后，选取菌落数在30个左右者进行计数蜡样 芽孢杆菌在此培养基上生成的菌落为红色（表示不发酵 甘露醇）,环绕有白色至淡粉红色的晕（表示产生卵磷脂 酶） 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定 • 计数后，从中挑取5个这样的菌落作证实试验根 据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该 培养皿内的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数 即得每克或每毫升样品所含的蜡样芽孢杆菌数 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定 计数后，从中挑取5个此种菌落做证实试验，根据证实 的蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该平板上的菌落数，然 后乘其稀释倍数，即得每克（毫升）样品中所含蜡样芽胞 杆菌数。

例如将0.1mL 10-4样品稀释液涂布于MYP平板上，其可疑 菌落为25个，取5个鉴定，证实四个菌落为蜡样芽孢杆菌， 则1g（mL）检样中所含蜡样芽孢杆菌数为： 选取具有15-150个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板, 进行计数计算同一稀释度两个平板的平均菌落数 25×4/5×104×10＝2×106 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定 3．分离培养 • 将检样或其稀释液划线于上述选择性培养基平板上 ，置37℃培养12～20h，挑取可疑蜡样芽孢杆菌的菌 落接种于肉汤和营养琼脂培养基上做纯培养，然后 做证实试验 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定 4．证实试验 （1）形态观察 • 本菌应为G＋杆菌，宽度在1μm或1μm以上，芽孢呈卵 圆形，不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端 （2）培养特性 • 本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环，振摇易乳化 。

琼脂平板上形成的菌落不透明，表面粗糙，似毛玻璃 状或融蜡状且边缘不齐 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定 （3）生化特性 • 本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化 氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；能 液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵葡 萄糖 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定 (4)生化分型 • 根据蜡样芽孢杆菌对柠檬酸盐利用、硝酸盐 还原、淀粉水解、V-P反应、明胶液化的试验 ，分成不同型别，见表1 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定 表1 蜡样芽孢杆菌生化分型 型 别 生 化 试 验 柠檬酸盐利用硝酸盐还原淀粉水解V-P反应明胶液化 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 ＋ － ＋ － － ＋ ＋ － － － ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － ＋ ＋ － ＋ － － ＋ － － ＋ ＋ － ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － － － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定。

（4）与类似菌鉴别 • 本菌与其他类似菌的鉴别见表2 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定 5.结果报告 • 报告1g（mL）检样中所含蜡样芽孢杆菌数量[个 /g(mL)] 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定 实验三、食品中蜡样芽孢杆菌的检验 一、实验目的 1．学习蜡样芽孢杆菌检验的原理和方法 2．了解蜡样芽孢杆菌形态特征、培养特性 和生化特性 为煤矿服务的矿井建设施工、洗煤厂、选煤厂是指煤矿企业附属的矿井建设施工企业、洗煤厂企业、选煤厂企业，与煤矿企业没有附属关系独立的洗煤厂和选煤厂不适用于本规定 v蜡样芽孢杆菌为需氧、能产生芽孢的革兰 氏阳性杆菌，在自然界分布较广，食品在正 常情况下就可能有此菌存在，因而易从各种 食品中检出蜡样芽孢杆菌能发酵麦芽糖、 蔗糖和水杨苷，不发酵乳糖、甘露醇、木糖 、阿拉伯糖、山梨醇和侧金盏花醇,卵磷脂酶 和酪蛋白酶，过氧化氢酶。