第七章蛋白质分离、纯化1电子教案.ppt

第七章 蛋白质的分离、纯化蛋白质分离、纯化主要依据 （1）蛋白质的分子大小 透析、超滤、分子筛层析（2）蛋白质的带电特性 等电点沉淀、离子交换层析、 等电聚焦电泳 （3）蛋白质的溶解特性 硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级分离 （一）材料（一）材料 1 1、选材、选材 2 2、破碎、破碎 3 3、混合物的分离、混合物的分离 （二）粗分级（二）粗分级 （三）细分级（三）细分级 一、盐析盐析：蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出 常用硫酸铵进行沉淀分级沉淀：通过调节硫酸铵的浓度可以使不同的蛋 白质分阶段沉淀下来优点：价格便宜、蛋白质沉淀完全、溶解过程发热少等不足：沉淀后蛋白质中含有大量硫酸铵，对后续纯化过程 产生不良影响v二、有机溶剂分级沉淀有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等（保持低温），能破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀优点：蛋白质沉淀不用脱盐、有机溶剂去除容易缺点：容易引起蛋白质分子的变性，实验过程严格低温三、超速离心法在强大的离心力的作用下，溶液中的不溶解的颗粒状物质会沉淀析出，从而使溶液和沉淀物质分开四、等电点沉淀法在一定的pH条件下，蛋白质所带的净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。

该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质Protein的等电点（PI） 1、定义：使蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等，即净电荷为零时的溶液的pH值称为PI(isoelectric point). 2、当pH值 PI 时，蛋白质带负电荷 当pH值PI 时，蛋白质带正电荷 当pH值=PI 时，蛋白质带净电荷为零电泳分离正极移动负极移动不移动五 透 析按照分子大小进行分离.分离取决于透析袋截留的分子量透析液浓缩的蛋白混合样品 透析袋 开始透析处于平衡状态一般用于除盐类和小分子杂质一般用于除盐类和小分子杂质五、透 析六、超滤除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质加压蛋白质溶液半透膜支持膜的栅板超滤液 采用分子筛层析、离子交换层析、亲和层析等手段结合多种电泳技术，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等进一步对蛋白质粗制品分离纯化，以获得高纯度的蛋白质样品，用于蛋白质结构、功能及其应用研究 蛋白质细分级一、凝胶层析 又叫分子筛层析又叫分子筛层析 分子筛是具有三维空间网状结构的物质，分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成根据网孔不同可制有天然的，也可人工合成根据网孔不同可制成不同规格成不同规格。

凝胶层析 原理：原理： 1 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质迁移速度快；质迁移速度快； 2 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢所以小分子物质迁移速度慢 具备条件：具备条件：1 1惰性，惰性，2 2水不溶性，水不溶性，3 3能高度水能高度水化 常用分子筛：常用分子筛： 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶（SephadexSephadex） 型号：型号：G200G200、 G150 G150、 G100 G100、 G75 G75、 G50G50、 G25 G25、 G15 G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐分离大蛋白质、小蛋白质，除盐 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶（瑞典（瑞典SepharoseSepharose、美国、美国Bio-GelABio-GelA） 孔径大，用于分离大分子物质孔径大，用于分离大分子物质 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP Bio-GelP）带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出凝胶过滤层析过程示意图 凝胶的前处理溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。

碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性酸洗：用0.5 M HCl 溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同1. 将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气2. 将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/41/3高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续侵入凝胶至沉降到所需高度装柱时要注意操作压3. 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使交换剂充分平衡，柱床稳定 装 柱样品上柱、洗脱、收集 1. 如图装好层析装置，打开下端出口，使溶液流出至刚好达到凝胶胶面2. 沿柱壁缓慢加入2ml样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁3. 打开起始缓冲液阀门，连续洗脱4. 用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管凝胶的再生及保存 再生 用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠 或0.002%双氯苯双胍己烷二、离子交换层析二、离子交换层析蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH 值。

当pI pH时，蛋白质带净正电荷注意：阳离子交换剂本身带负电荷，阴离子交换剂本身带正电荷离子交换层析 可分为阳离子交换与阴离子交换可分为阳离子交换与阴离子交换 1 1、树脂类：分离氨基酸，孔径小；、树脂类：分离氨基酸，孔径小； 2 2、纤维素类：分离蛋白质，孔径大纤维素类：分离蛋白质，孔径大通过改变盐浓度，辅助改变通过改变盐浓度，辅助改变pHpH值进行梯度洗脱值进行梯度洗脱阳离子交换层析过程离子交换树脂蛋白质低离子强度洗脱液洗高离子强度洗脱液洗加样平衡液洗收集离子交换层析三、亲和层析 原理： 依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的专一识别并结合的特性来分离蛋白质 配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体. 含配体溶液收集目的蛋白 洗下未结合的蛋白混合蛋白样品平衡液带有配体的树脂珠（或胶粒）电泳法 类型：类型： 1 1、区带电泳、区带电泳 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。

丝电泳、凝胶电泳 凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电泳聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电泳、等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳 2 2、自由界面电泳、自由界面电泳：支持物为溶液，很少用支持物为溶液，很少用1原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP) 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶优点1) 化学性能稳定，对pH和温度变化不敏感；2) 重复性好；3) 灵敏度高，可达10-6 g；4) 分辨率高分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5分子量范围与凝胶浓度的关系凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关垂直板电泳垂直板电泳垂直板电泳蛋白质微型电泳系统SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 1、由于、由于SDSSDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。

差异 2 2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDSSDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的分子量的大小成正比大小成正比变化SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验方法： 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶的制备 蛋白质样品准备 点样 电泳 染色与脱色 样品回收 等电聚焦（ Isoelectric focusing）(1)(1)以不同蛋白质的以不同蛋白质的等电点的差异等电点的差异分离2)(2)凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质3)(3)载体两性电解质：载体两性电解质： a a 是一系列物质的混合物此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不是一系列物质的混合物此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能相差太大（小数点后能相差太大（小数点后2 2位）；最常用为位）；最常用为3.0-10.03.0-10.0范围，还有范围，还有3.0-7.03.0-7.0、5.0-5.0-10.010.0 b b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列；混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、多羧基的脂肪族化合物；、多羧基的脂肪族化合物； d d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。

要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离等电聚焦（ Isoelectric focusing） 通电后，在介质中由于通电后，在介质中由于H H+ +与与OHOH- -的相向移动，形的相向移动，形成了从成了从3.0-10.03.0-10.0的一系列的一系列pHpH梯度当载体两性电解梯度当载体两性电解质移动到各自的等电点时，就停止移动，不带电荷质移动到各自的等电点时，就停止移动，不带电荷，并维持，并维持pHpH梯度（电导、缓冲能力）梯度（电导、缓冲能力） 即：即：pHpH梯度由梯度由H H+ +与与OHOH- -建立，而由载体两性电解建立，而由载体两性电解质来维持当蛋白质移动到相应的质来维持当蛋白质移动到相应的pHpH值处，结束值处，结束 注意事项注意事项：1 1、时间相对长对分离有利；、时间相对长对分离有利； 2 2、也可用来测定蛋白质的等电点也可用来测定蛋白质的等电点等电聚焦（ Isoelectric focusing）蛋白质含量测定与蛋白质鉴定 在蛋白质工程的相关研究中，不仅需要经常测定蛋白质含量，而且要对目标蛋白质进行鉴定 蛋白质含量测定有很多方法凯氏定氮法 双缩脲法 福林-酚法 考马斯亮蓝比色法 紫外吸收法 蛋白质鉴定包括很多内容，蛋白质分子量与等电点的测定 蛋白质氨基酸组成及顺序的分析 蛋白质结晶与结构分析 蛋白质生物活性及功能测定 蛋白质含量测定 最经典的蛋白质含量测定方法是凯氏定氮法，其基本依据是蛋白质平均含氮量为16%，假设测得样品中的含氮量为1 g，所有的氮以蛋白质的形式存在，则蛋白质含量为1/16%=6.25 g。

紫外吸收差法是最简单便捷的蛋白质含量测定方法，分别测定样品在280nm和260nm的光吸收值，利用经验公式，蛋白质浓度（mgmL）1.45A280 nm0.74A260 nm，很容易计算出样品的蛋白质含量 分光光度法是主要的蛋白质含量测定方法，首先将蛋白质样品与特定的显色剂反应，反应产物在特定波长的光吸收与蛋白质含量成正比，利用标准曲线即可查得样品的蛋白质含量 蛋白质鉴定蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：蛋白质纯度鉴定 蛋白质分子量及等电点测定蛋白质氨基酸组成及顺序分析 蛋白质结晶与结构分析 蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴定 蛋白质生物活性及功能测定 （一）蛋白质纯度鉴定： 目前最常用的蛋白质。