微球层叠微通道用于全血血浆分离.docx

微球层叠微通道用于全血血浆别离 陈梦迪杨雁婷邓治杨徐洪燕邓吉楠杨忠胡宁杨军摘要设计并制作了一款由两种大小不同微球层叠堆积的微通道与毛细通道阵列组合而成的微流控芯片装置，可以在全血样本流经微通道过程中，通过微球堆积层过滤、吸附其中的细胞组分，快速别离出血浆采用负压进样方式在微通道中紧密堆积微球，并采用蛋白封闭液包被的方法增加微球外表亲水性，在毛細作用下，芯片烘干冷却后滴入的全血在微通道中前进，进而别离出血浆测试了直径分别为10、15、20、23和40μm的不同微球对血浆别离速度的影响，当使用直径为10μm的微球堆积通道时，血浆别离速率最快考察了堆积通道局部加宽设计等对血浆别离的影响，结果说明，相较于长直型通道，局部加宽通道的血浆别离速率大大增加，最快可达0.16μL/min，可在短时间内收集得到足量血浆，满足大多数临床血液检测等相关要求利用本方法收集的血浆样本在芯片上进行血液凝集实验，可快速分析待测血液血型，具有良好的实际应用价值关键词血浆;微流控芯片;全血;毛细作用;过滤1引言全血由红细胞、白细胞、血小板等血细胞和血浆组成【1】，血细胞占全血的40%～45%，血浆占55%～60%血浆成分复杂，主要包括蛋白质、脂类、无机盐、糖等，很多成分与人体的各种生命活动直接相关，因此，检测分析血浆成分对根底生物医学研究及临床检测都有重要意义【2】。

由于血细胞及其所含物质常会干扰血浆成分分析，在相关检测中，需提前去除血细胞在传统的实验室分析方法中，别离血浆最常用的方式是对全血进行离心操作，取上清液即可得到血浆但是，血液即时检测〔Point-of-caretesting，POCT〕设备得到越来越广泛的应用，基于离心的血浆制备方法由于所需装置较大、本钱较高，难以满足实际检测要求【3】微流控芯片因其结构尺寸小、本钱低、通量高、试剂消耗少、反应快等优势，已被广泛用于各种POCT设备中【4】对于全血中血浆的别离，微流控技术同样具有巨大应用潜力，因此成为目前该领域的研究热点，已有多种不同的微流控装置被用于血浆别离研究中[5～14]其中，具有天然多孔结构的纤维薄膜、滤纸等材料较多用于微流控血浆别离，对血液的操作可采用类似传统生化试纸的侧向流层析方法，如目前常见的纸质芯片结构【5】此外，也有研究利用红细胞的侧向位移，在靠近壁的一侧形成一层无细胞区域以别离血浆【6】另一类方法那么较多依赖于多孔薄膜的过滤作用[7，8]这些装置结构简单、本钱低廉，但是所得到的血浆量通常较少，而且是吸附在多孔结构中或薄膜外表上同时，这类结构的滤孔也易被堵塞，实际应用范围有限。

由于微流控技术已经广泛应用于细胞别离领域[9]，因而又陆续出现了多种微流控结构及操作方法以实现血浆别离基于错流过滤的微流控血浆别离方法[10，11]，利用单一通道尺寸小于血细胞的微通道阵列限制血细胞的流动，从而实现血细胞和血浆在平行通道中的分配，到达别离血浆的目的模仿体内毛细血管中细胞流动的Zweifach-Fung效应〔即分支毛细血管结构中血细胞倾向于流入流速更高通道的一种效应〕也被用于血浆别离芯片的构建[12，13]，血液流经微通道的分叉处时，由于受到较强压力梯度的作用，绝大多数血细胞倾向于流入流速高的微通道中，从而实现血浆在低速分支通道中的别离在微流控芯片中，还可利用一些特殊几何结构构成的阵列，如通道中突起的斜纹结构阵列，改变血细胞的流动方向，并向特定方位富集，从而实现血浆别离[14]除了各种微结构，流体的特殊微流控操作也可用于血浆别离如在惯性微流过滤中，利用微通道中细胞所受惯性升力的平衡点，可使血细胞稳定在通道横截面中某个位置形成聚焦流动，从而完成血细胞的别离[15]相比于传统的多孔介质的血液渗流及过滤别离方法，基于特殊微结构或者微流控操作技术的血浆别离方法速度更快，所得到的血浆量也更多，更适于POCT分析。

但是，在微通道中加工各种微结构的工艺复杂，造价昂贵;而各种微流控操作方法对加工及流动控制精度的要求也较高;同时，很多血浆别离都需对血液做稀释等预处理，不适合直接对全血进行操作，限制了其推广应用Shim等[16]利用不同尺寸的微球在微流控芯片的进样池与微通道连接处堆积形成一个过滤系统，通过微球间间隙对血细胞的阻挡作用及血液的毛细作用，选择性地使血浆更快流到后端微流控通道中，实现血浆的快速别离该方法依赖于微流控结构中的毛细作用，不需外加驱动装置，结构和制作简单，别离速度也较快但是，该设计在实际应用中还存在一些问题，如微球仅依靠相互粘结固定在微通道入口位置，抵抗外力干扰能力弱，容易脱落、移位血浆别离完全依靠毛细作用驱动，流动通道尺寸不能太大，这也导致单一通道设计很难将足够别离血浆输送到后端尺寸较大的检测微腔室等结构中〔这些结构中毛细作用很弱〕由于光学检测技术等要求，较大检测腔室在微芯片生化检测及免疫分析等应用中广泛使用[17];同时，较小尺寸的微通道中单次别离血浆量少〔一次最多102nL〕，也限制了其应用范围由于微球堆积层厚度较薄，延长别离时间会导致局部红细胞穿过微球堆积层，污染已经别离的血浆。

本研究构建了一种基于微球堆积微通道和毛细微通道阵列的微流控芯片结构，利用特定微通道约束不同尺寸的微球，使血液在通过层叠微球过程中实现血细胞和血浆的别离血浆别离过程中，无需借助外力作用通过填装大量微球于微通道中，可以提高别离的血浆量;同时，微球层叠通道下游的阵列化微通道结构相比单一微通道更有利于大量血浆的收集探究了微球尺寸和芯片结构对血浆别离过程的影响相较于同类型微球堆积血浆别离装置，本装置别离血浆速度更快，血浆收集量更大2实验局部2.1仪器与试剂LSP10-1B实验室十通道注射泵〔保定兰格恒流泵〕;URE-2000/25型紫外光刻机〔中国科学院光电技术研究所〕;PDC-MG等离子清洗机〔成都铭恒科技开展〕;IX73显微镜〔日本奥林巴斯公司〕;EOS600D照相机〔日本佳能公司〕磷酸盐缓冲液〔Phosphatebuffersaline，PBS〕干粉〔北京索莱宝科技〕;吐温20〔合肥博美生物科技有限责任公司〕;封闭蛋白干粉〔美国博士德生物工程〕;聚二甲基硅氧烷〔Polydimethylsiloxane，PDMS，美国DowCorning公司〕;SU83050〔美国MicroChem公司〕;二氧化硅微球〔直径分别为10、15、20、23和40μm，中国知益微球科技〕。

2.2芯片设计及加工血浆别离的目的是将血液中的血细胞与血浆有效分开血细胞中绝大多数都是红细胞，约占血液体积50%因此，血浆别离的主要目的就是去掉红细胞红细胞呈两面中央凹的圆饼状，直径约8μm，厚度约2μm，具有极强的变形性，可形变通过小于其几何尺寸的孔道，但压力过大时也可能破裂芯片〔图1〕中设计了一条填充微球的微通道，通过微球之间的孔隙一定程度上阻滞红细胞运动，同时通过毛细作用使血浆快速流经微通道，从而实现血浆的别离微流控芯片由上下两层结构组成〔图1A〕，上层为PDMS层，下层为玻璃基底层芯片中的流动网络主要由全血进样腔、微球层叠通道、血浆别离通道阵列、血浆收集腔等局部组成其中，进样腔直径为4mm微球层叠通道的尺寸为14.8mm〔长〕4mm〔宽〕220μm〔高〕，用以容纳微球通道一侧刻有刻度标志〔相邻刻度间距为1mm〕，方便确定微球堆积数量微球层叠通道后端与18条尺寸分别为1.5mm〔长〕100μm〔宽〕85μm〔高〕的血浆别离通道相连〔图1B〕别离的血浆最后流入尺寸为4.6mm〔长〕2.1mm〔宽〕220μm〔高〕的血浆收集腔在微球装填过程中，先将较大尺寸微球填充到微球层叠通道中，挡住其进入血浆别离通道的入口，防止随后堆积的尺寸较小微球进入别离通道中。

通过外表处理使微球外表具有较强的亲水性由于毛细作用与毛细管的半径成反比，因此可以通过选择微球尺寸调节毛细作用[18]微球相互堆积形成孔隙，起到了毛细管的作用，此处将孔隙模拟为一根长直的毛细管，在毛细管的一端添加液体，不施加其它力的作用，模拟液体在毛细管内的前进采用COMSOLMultiphysics4.4软件进行仿真当毛细管直径变小时，液体在毛细管中前进的速率明显加快芯片加工时，首先采用二次光刻法在硅片上制備由两层不同高度〔220μm/85μm〕的微结构构成的母版：〔1〕在洗净烘干的硅片上旋涂一层光刻胶SU83050〔1500r/min，1min〕;〔2〕前烘45min后曝光〔27s〕;〔3〕后烘，显影得到第一层结构〔高85μm〕;〔4〕重复操作得到第二层结构〔SU82050，500r/min，1min，所得光刻胶高220μm〕，最终得到有双层结构的硅片母版将PDMS倒入固定母版的模具中，除尽气泡后，在80℃的烘箱中加热30min，脱模即可得到具有预定微结构的PDMS胶块，然后在PDMS胶块上进样腔和收集腔气孔位置打出相应尺寸通孔芯片采用玻璃作为基底材料，玻璃基底具有良好亲水性，有利于微球溶液的进入。

将玻璃基底和PDMS胶块等离子处理3min后键合，并在150℃热压10min即得到实验芯片〔图1C〕待芯片冷却后，尽快参加蛋白封闭液〔0.065g/mL〕，以包被通道外表，增加其亲水性蛋白封闭液由封闭蛋白干粉溶于吐温20-PBS缓冲液〔1∶2000，V/V〕2.3实验过程2.3.1微球堆积在芯片中，起过滤作用的主要是小尺寸的微球在微球堆积通道中填充微球时，为防止尺寸小的微球从别离微通道中流失，芯片内共堆积两种尺寸的微球，先堆积直径100μm的微球，再堆积较小尺寸的微球将实验所用的二氧化硅实心微球参加去离子水中，形成微球悬液，从进样腔入口参加后，在收集腔出口一端抽气形成负压，可使微球在通道内堆积通过芯片上的刻度标志可以判断并控制不同微粒堆积量在微球堆积过程中，微球始终浸润在蛋白封闭液中，蛋白在微球外表吸附，可将其外表从疏水性改变为亲水性，显著提高毛细作用强度堆积微球的微芯片如图2A所示将填充好微球的芯片中的蛋白封闭液尽量抽尽后，于75℃烘烤至水分全部蒸发，冷却后，于4℃放置过夜，备用2.3.2血浆别离实验血液样本采用作者本人血液，由重庆大学医院采集，经重庆大学医院同意，可用于实验将20μL血液样本参加进样腔中观察并记录血浆别离情况〔图2B〕。

由于毛细作用，血液会自动在通道内前进微球与通道壁及微球间的狭窄缝隙有助于产生较大的毛细作用力，推动血液中的血浆流动较小缝隙对以红细胞为主的血细胞那么有较大阻碍作用血液在进入芯片一段时间后，红细胞和血浆运动前沿会出现一定程度的别离3结果与讨论3.1血浆的别离参考文献[16]的研究结果，在实验中先选择直径分别为100μm和15μm的两种尺寸的微球，其中大微球的填充量约0.88μL〔占据1mm长的通道〕，小微球的填充量约12.32μL〔占据14mm长通道〕当血液从进样腔参加芯片后，血浆在毛细作用下向前运动，而血液中的红细胞由于微球的阻碍而逐渐滞后经过一段时间后，血浆〔图3中的透明局部〕运动的前沿明显超越红细胞〔红色局部〕的运动前沿，说明局部血浆成分逐渐从血液中别离出来从微球区域流出的血浆在下游的别离通道阵列中快速流动，随后进入收集腔逐渐积累芯片中收集腔和微粒堆积通道高度均为220μm，而中间的别离通道高度为85μm，当血浆从不同别离通道进入收集腔时，不同别离通道流入的血浆逐渐汇流到一起，从收集腔的角落处开始慢慢积累〔图3C〕最后，收集腔中得到淡黄色透明血浆，说明在整个别离过程中根本没有红细胞被挤压破裂。

相对于Shim等[16]设计的芯片结构，本研究中的芯片更厚的微球堆积层可实现更多的血浆别离;同时，由18条别离通道构成的阵列可同时输送更多的血浆进入收集腔室实验中还发现，由于血浆的不断别离，剩余血液中血细胞浓度不断增加，粘度也不断加大，流速减慢，导致最终未别离的血液〔主要是红细胞〕会停留在微通道。