分子遗传学3纸板v讲课教案.ppt

第三章 DNA的复制 复制（replication）：是指以原来的DNA分子作为模板合成出相同分子的过程n复制在保持生物稳定性方面起重要作用；n复制是细胞分裂的前提和基础；n复制是精确的复制，一般不会差错；n复制方式为半保留复制（semiconservative replication） 第一节 半保留复制的验证 半保留复制：亲代DNA的两条链解开，每条链都作为模板形成两个子代DNA分子；新合成的每个子代DNA分子中，一条链来自亲代DNA分子，另一条链是新合成的n半保留模型（semioconservetivemodel）n全保留复制模型(conservetivemodel)n分散模型(Dispersivemodel) 第二节 复制的起点、方向和终点 一. 研究方法： 1. 用同位素标记电镜观察：1973年R. L. Rodrigue等提出的，验证了E. coli环状DNA是双向复制，一个复制起点，且终点在起点对面2. 用噬菌体插入标记法 同步培养 不同步培养 3. 变性定性法4. 双向电泳法 二、原核的复制起点和方向复制起点（origin,ori）：DNA分子上特定的发动复制 的起始位点。

复制终点（terminus）：DNA分子上复制终止的位点复制子（replicon）：从复制起点到复制终点这样一个 完整的DNA单位称为复制子n原核细胞基因组实质为一条双链DNA分子，作为一个复制子，整个基因组的复制起始于单一位点（起点）；n真核细胞基因组庞大，有多个复制起点和复制终点，含有多个复制子 复制的特点：nE.coli定点、双向对称复制;nT7（噬菌体）在近一端的17处开始，向两端延伸;n枯草杆菌有固定的起始点，双向不对称复制; 一侧复制基因组的4/5，另一侧只复制1/5，终点也不在Ori的对面n质粒R6K早期为单向复制，复制了约1/5基因组时进行双向复制;n质粒Col E1有固定起始点，但却为单向复制;nmt（线粒体）DNA进行D（displaced loop）环复制8D-环复制时需合成引物mtDNA为双链，第一个引物以内环为模板延伸至第二个复制起始点时，又合成另一个反向引物，以外环为模板进行反向的延伸最后完成两个双链环状DNA的复制复制中呈字母D形状而得名dNTPDNA-pol n复制过程n在研究真核细胞内线粒体DNA的复制时，发现了DNA的D环复制复制过程四阶段D环复制的特点是两条链的复制不是同步的。

n1.H链首先合成：在复制起点处以H链为模板，合成RNA引物，然后由DNA聚合酶催化合成一个500-600bp长的H链片段该片段与H链以氢键结合，将亲代的L链置换出来，产生D环复制中间物新的H链DNA片段由于分子3端终止的位置不定而长短不一;也有一些3端位置是固定的，而由于5端被降解而使整个DNA片段长短不一合成这样500-600bp长的DNA片段不会引起线粒体DNA超螺旋结构的明显改变n2.H链片段的继续合成：上述产生的H链片段由于太短而很容易被挤出去恢复线粒体DNA完整的双螺旋结构但有时这个片段会继续合成，这需要依靠拓扑异构酶和螺旋酶的作用将双链打开n3.L链合成开始：以被置换下来的亲代L链为模板，离H链合成起点60%基因组的位置开始合成L链DNA，合成也需要RNA引物n4.复制的完成：H链的合成提前完成，L链的合成随后结束线粒体DNA合成速度相当缓慢，约每秒10个核苷酸，整个复制过程需要1个小时刚刚合成的线粒体DNA是松弛型的，需要40分钟将其变成超螺旋型n考察基因功能的常用方法-突变体的表型变化突变型可分为二类：一类为可以补偿的； 另一类为不可补偿的；n考察复制有关酶的常用突变型- 温度敏感突变体 此突变体属于条件致死突变型，即：在25正常生长，42不能生长致死。

第三节 原核生物复制的酶系统n利用大肠杆菌温度敏感突变体研究与复制有关基因(dna) 一般复制的过程包括：起始、延伸和终止3个阶段每一阶段的蛋白质和酶不完全相同，可利用如下2种突变体来筛选 快停突变体：温度升高(42-45)，复制立即停止缺失复制体组分的 酶，特别是延伸的酶或参与供应关键前体的酶dna突变体 慢停突变体：在非允许温度下(42-45) ，可以完成当前的复制，但不 能开始新的复制缺失复制起始有关的酶一、DNA聚合酶(DNA polymerase)全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-pol DNA聚合酶的共同特点：n需要提供合成模板；n不能起始新的DNA链； 必须要有引物（一小段DNA或RNA）提供3-OH，在此基础上聚合添加；n合成的方向都是53（即子链是53）；n除聚合DNA外还有其它功能（如校对、修复等） E.coli 中主要的三种DNA多聚酶DNApolDNApolDNApol结构分子量103KD90KD900KD构成单体单体异多聚体分子数/细胞400？10-20酶活性：53聚合酶+35外切酶+53外切酶+(可切单链)突变体突变位点pol Apol BpolC(dnaE), dnaN, dnaZX, dnaQ, dnaT突变表型修复有缺陷能修复阻止复制（一）DNA聚合酶In发现：西班牙裔美国人A. Kornberg等在1956年完成第一例体外合成DNA实验。

从大肠杆菌中分离得到一种酶，此酶可以将核苷酸共价连接在一条已经存在的DNA链上，称此酶为DNA聚合酶I或Kornberg酶15 单一肽链的大分子蛋白质，分子量约为109KD，每个细胞中大约存在400个DNA-pol (109kD)DNA聚合酶I的结构（要求）由PolA基因编码的单个肽链，MW：103KD可被枯草杆菌蛋白切成2个片段： 小片段位于N端35KD 大片段位于C端68KD即Klenow片段DNA聚合酶I有6个结合位点；n模板结合位点；(有引物的ssDNA,有缺口的dsDNA)n引物结合位点；(引物可以是一小段DNA或是RNA)n引物3OH结合位点；n底物dNTP结合位点；n53外切酶结合位点；（位于N端小片段）n35校正位点靠C端大片段偏中间部位）17323个氨基酸小片段5-3核酸外切酶活性大片段/Klenow 片段 604个氨基酸DNA聚合酶活性 3-5核酸外切酶活性N 端C 端木瓜蛋白酶DNA-pol DNA聚合酶的功能（要求）对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补1. 53聚合功能；主要用于DNA的修复和后随链中RNA引物的置换2. 35外切活性；主要起校正功能，切除合成中错配的碱基。

3. 53外切活性； (1)切口平移（nick translation）； (2)链的置换； (3)模板转换（template-switching）；4.内切酶活性：主要用于切除修复系统，正常复制中无19（二）DNA-pol （120kD）DNA-pol 基因发生突变，细菌依然能存活DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复三）DNA多聚酶n发现：针对一株dnaE基因缺失突变型的研究，其在25可以正常生长合成DNA，当转移至43时，DNA的复制过程终止，这表明dnaE的表达产物是DNA合成所必需的n证实dnaE基因的编码产物是DNA聚合酶III的亚基，其具有53聚合酶活性21DNA pol （830kD）n功能：是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶22由十种亚基构成的不对称异二聚体253 聚合酶活性3-5外切酶活性和碱基选择功能维系二聚体的作用DNA多聚酶结构组成如下图：全酶在DNA上的装配分为三个阶段n一个二聚体加上一个复合体识别引物模板形成一种前起始复合物；nDNA在与、复合体结合的位点构象发生改变，而对核心酶产生了高亲和力使核心酶能与DNA结合；n二聚体结合核心聚合酶，使其二聚化。

DNA多聚酶的功能n53聚合酶功能：能催化DNA沿53 方向延长对模板要求高，仅有缺口100nt的dsDNA才可做模板n35外切酶活性：与DNA聚合酶I相同，有校对功能n53外切酶活性：与DNA聚合酶I不同，仅能以单链为底物，不能进行缺口平移DNA多聚酶是合成DNA的主角，一般合成长片段如前导链和后随链冈崎片段的合成26原核生物的DNA聚合酶27常见的真核细胞DNA聚合酶DNA-pol 起始引发，有引物酶活性合成前导链，参与合成后随链链; /复合物沿着DNA模板进行子链的延伸DNA-pol 粒体DNA复制中起催化作用DNA-pol 高保真修复，碱基切除修复DNA-pol 在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用DNA-pol 二、DNA连接酶（DNA ligase） *作用是连接DNA分子，将相邻的3-OH和5-P连接成磷酸二酯键，封闭缺口其作用过程分三步进行：1. EATPEAMPppi 在E.coli中：ENADEAMPNMN2. E-AMP上的AMP转移到DNA的5-PO4上使其活化；3. 活化的5-PO4与相邻的3-OH作用形成35 磷酸二酯键，并释放出AMP *此酶在后随链的合成、DNA的损伤修复、重组及转座中发挥重要的作用。

29需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi；需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能 未封闭的切口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；DNA连接酶的催化特点：30DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用是基因工程的重要工具酶之一DNA连接酶的作用： 三、螺旋酶（helicase） 又称解旋酶，是解开氢键促进DNA的两条互补链分离的酶n是DNA复制、重组、修复过程中关键的发动蛋白；n具有依赖DNA的ATPase活性，利用ATP水解产生的能量解旋DNA并使螺旋酶沿DNA链移动一般每解开一对碱基需要水解一个ATP 与产物单链DNA结合，如螺旋酶，螺旋酶螺旋酶 仅仅催化DNA双链的分离，常与SSB蛋白结合 如E.coli 中rep蛋白，螺旋酶四、单链结合蛋白SSB（single binding protein）单链结合蛋白：又称双螺旋去稳定蛋白(helix destabilizing protein)，可以结合单链，防止形成双链或发夹结构，同时保护单链不被核酸酶水解n在E.coli 中，SSB是由177个aa组成的蛋白质; 以四聚体存在;分子量为74KDa;结合单链DNA可覆盖32nt，保护DNA。

n在原核中SSB与DNA结合表现出协同效应（第一个SSB的结合能力是1，则第二个SSB的结合能力为1000）：（1）SSB之间的相互作用；（2）第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构n真核生物的复制系统中具有复制因子A（RF-A）相当于SSB，但无协同作用34DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用 DNA复制的拓扑性质 五、拓扑异构酶35nDNA复制时，两条链打开，必然造成DNA分子形成缠绕、打结、连环等现象，从而产生扭曲张力n闭环状的DNA按一定方向扭转形成超螺旋盘绕过分称为正超螺旋，盘绕不足为负超螺旋复制时，部分DNA要呈松弛状态36拓扑异构酶的作用特点: 既能水解 、又能连接磷酸二酯键 *拓扑异构酶 * *拓扑异构酶 拓扑异构酶分 类 拓扑异构酶（topoisomerase）拓扑异构酶：催化DNA环的拓扑异构体之间转化的酶，它可以在切割DNA的单链或双链后，催化一个 DNA分子单链或双螺旋链穿过断裂的单（双）链再重新闭合37拓扑异构酶I切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态反应不需ATP如大肠杆菌DNA拓扑异构酶。

拓扑异构酶II无ATP时，切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛利用ATP供能时，使松弛DNA分子进入负超螺旋状态，连接断端如大肠杆菌的DNA旋。