基因组测序的原理与方法a知识课件知识讲稿.ppt

大规模基因组测序的原理与方法胡松年 元素周期表的发现奠定了二十世纪物理、化学研究和发展的基础元素周期表“基因组序列图”将奠定二十一世纪生命科学研究和生物产业发展的基础！ “基因组”-生命科学的“元素周期表”人体解剖图奠定了现代医学发展的基础生命的奥秘蕴藏于 “四字天书”之中GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCA TCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCT CCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTC GCTTTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT 基因组学是一个基因组学是一个大学科大学科 “ “界门纲目科属种界门纲目科属种” ”，地球上现存物种近亿，所有生生灭，地球上现存物种近亿，所有生生灭灭的生物，无一例外，都有个基因组灭的生物，无一例外，都有个基因组 基因组作为信息载体，它所储存的信息是最基本的生物基因组作为信息载体，它所储存的信息是最基本的生物学信息之一；既是生命本质研究的出发点之一，又是生学信息之一；既是生命本质研究的出发点之一，又是生物信息的归宿。

物信息的归宿 基因组学研究包括对基因产物（转录子组和蛋白质组）基因组学研究包括对基因产物（转录子组和蛋白质组）的系统生物学研究的系统生物学研究 基因多态性的规模化研究就是基因组多态性的研究基因多态性的规模化研究就是基因组多态性的研究 基因组学的研究必然要上升到细胞机制、分子机制和系基因组学的研究必然要上升到细胞机制、分子机制和系统生物学的水平统生物学的水平 基因组的起源与进化和物种的起源与进化一样是一个新基因组的起源与进化和物种的起源与进化一样是一个新的科学领域的科学领域 基因组信息正在以天文数字计算，规模化地积累，它的基因组信息正在以天文数字计算，规模化地积累，它的深入研究必将形成一个崭新的学科深入研究必将形成一个崭新的学科 基因组学是一门基因组学是一门大科学大科学 基因组的信息是用来发现和解释具有普遍意义的生命基因组的信息是用来发现和解释具有普遍意义的生命现象和它们的变化、内在规律、和相互关系现象和它们的变化、内在规律、和相互关系 基因组的信息含量高基因组学的研究又在于基因组基因组的信息含量高基因组学的研究又在于基因组间的比较间的比较 基因组学的复杂性必然导致多学科的引进和介入（各基因组学的复杂性必然导致多学科的引进和介入（各生物学科、医学、药学、计算机科学、化学、数学、生物学科、医学、药学、计算机科学、化学、数学、物理学、电子工程学、考古学等）。

物理学、电子工程学、考古学等） 基因组学研究的手段和技术已经走在生命科学研究的基因组学研究的手段和技术已经走在生命科学研究的最前沿 基因组信息来自于高效率和规模化所产生的实验数据基因组信息来自于高效率和规模化所产生的实验数据 人类基因组计划证明了基因组研究的迫切性和可行性人类基因组计划证明了基因组研究的迫切性和可行性基因组与生命之谜基因组与生命之谜 基因组的产生与进化基因组的产生与进化 基因组基因组DNADNA组分的变化、组分的变化、GCGC百分比、嘌呤：嘧啶守恒百分比、嘌呤：嘧啶守恒 遗传密码的发生、发展和进化遗传密码的发生、发展和进化 内含子（尤其是大于内含子（尤其是大于100100，000 000 核苷酸的大内含子）剪核苷酸的大内含子）剪出后的运输和降解出后的运输和降解 最小内含子的生物学意义最小内含子的生物学意义 动物基因组与植物基因组在基因分布上的共性和个性动物基因组与植物基因组在基因分布上的共性和个性 物种衍变过程中基因组水平的变化物种衍变过程中基因组水平的变化 基因组大小变化与遗传、分子、细胞机制的关系基因组大小变化与遗传、分子、细胞机制的关系 “ “JUNK DNAJUNK DNA” ”的发生、分类、进化与功能。

的发生、分类、进化与功能测序设备的垄断和高速度换代8199020052020Year2015201020001995Mb1000Mb4000ABI373ABI377ABI3130ABI3730ABI3730 xlGA-I GA-IILess Than 5 yrsHiSeq1000/2000Mb4500ABI3700ABI3700 xlSOLiDSOLiD2SOLiD35500 xl SOLiDABI3130 xlGA-IIx5500 SOLiD测序设备发展现状9 第一代（稳定需求） ABi 3130 xL 3730 xL 3500 xL 第三代（即将面市） Helicos Biosciences Helicos Genetic Analysis System Pacific Biosciences RSSystem 第二代（高速发展） Roche Genome Sequencer FLX System GS Junior System Illumina Genome Analyzer IIx MiSeq HiSeq 1000 HiSeq 2000 Life Technologies (ABi) 5500 SOLiD System 5500 xL SOLiD System Ion Torrent PGM DanaherMotion Polonator G.007 Complete Genomics 无锡艾吉因生物信息技术有限公司 AG-100 深圳华因康基因科技有限公司 Pstar-1 中科院北京基因组所/半导体所 BIGIS-1 BIGIS-4大规模基因组测序的几个支撑技术大规模基因组测序的几个支撑技术vv SangerSanger双脱氧末端终止双脱氧末端终止法法vv PCR PCR 技术技术vv DNA DNA 自动测序仪的发展自动测序仪的发展vv 生物信息学分析软硬件设施生物信息学分析软硬件设施“ “双脱氧末端终止双脱氧末端终止” ”的含义的含义 PCRPCR（聚合酶链式反应）原理（聚合酶链式反应）原理反应所需物质：DNA模板、引物、DNA聚合 酶、dNTP、缓冲液每个循环包括：变性（90）、退火（54 ）、延伸（72 ）Sanger Sanger 双脱氧末端终止法测序原理双脱氧末端终止法测序原理大大 规规 模基因组模基因组 测测 序序 的的 两两 种种 策策 略略 逐步克隆法逐步克隆法（Clone by CloneClone by Clone） 全基因组霰弹法全基因组霰弹法 （Whole Genome Shot-gun)Whole Genome Shot-gun)ATGCCGTAGGCCTAGC TAGGCCTAGCTCGGA ATGCCGTAGGCCTAGCTCGGA基因组DNABAC文库根据物理图谱正确定位的BAC 或contig用于霰弹法测序的候选克隆用于霰弹法测序的亚克隆测序并组装完整的基因组序列逐步克隆法（Clone by Clone） 全基因组霰弹法 （Whole Genome Shot-gun)基因组DNA 霰弹法克隆测序并进行全基因组序列组装完整的基因组序列 两种大规模基因组测序策略的比较两种大规模基因组测序策略的比较 项项 目目 策策 略略全基因组霰弹法全基因组霰弹法逐步克隆法逐步克隆法 遗传背景遗传背景不需要不需要需要（需构建精确的需要（需构建精确的物理图谱）物理图谱）速度速度快快慢慢费用费用低低高高计算机性能计算机性能高（以全基因组为单高（以全基因组为单位进行拼接）位进行拼接）低（以低（以BACBAC为单位进为单位进行拼接）行拼接）适用范围适用范围工作框架图工作框架图精细图精细图代表测序物种代表测序物种果蝇、水稻果蝇、水稻人、线虫人、线虫BACbyBACWholeGenomeShotgunthe sequencing of the human genome is likely to be the only large sequencing project carried to completion by the methods described in this issue.Maynard V. Olson , Themaps: Clone by clone byclone,Nature409,816-818(2001)“WorkingDraft”(90%; 4X)FinishedGenome(99.99%; 8X)Gap1Gap2Chromosome工作草稿（框架图）与完成图BAC by BAC ThesequenceofthehumangenomeC.Venteretal.Science16Feb.291:13041351,2001人类基因组计划研究的主要成果和进展表现在这“四张图”上 遗传图谱 又称为连锁图谱（linkage map），指基因或DNA标志在染色体上的相对位置与遗传距离物理图谱 以定位的DNA标记序列如STS作为路标，以DNA实际长度即bp、kb、Mb为图距的基因组图谱。

转录图谱 利用EST（expressedsequencetags 表达序列标签）作为标记所构建的分子遗传图谱序列图谱 通过基因组测序得到的，以A、T、G、C为标记单位的基因组DNA序列 逐步克隆法逐步克隆法（Clone by Clone)Clone by Clone)物理图谱的构建大片段克隆的筛选霰弹法测序与“工作框架图”的构建序列的全组装与“完成图”构建物理图谱的制作物理图谱的制作物理图谱的制作序列标签位点（序列标签位点（STSSTS）作图）作图物理图谱是以特异的DNA序列为标志所展示的染色体图标志之间的距离或图距以物理距离如碱基对（base pair；bp，Kb , Mb)表示最精细的物理图是核苷酸顺序图，最粗略的物理图是染色体组型图 STS图谱是最基本和最为有用的染色体物理图谱之一，STS（Sequence Tagged Site)本身是随机地从人类基因组上选择出来的长度在200300bp左右的特异性短序列（每个STS在基因组中是唯一的，STS图谱就是以STS为路标（平均每100Kb一个），将DNA克隆片段有序地定位到基因组上 STS的来源随机基因组序列表达基因序列，如EST遗传标记序列，如微卫星标记有关STS的信息可在基因组数据库GDB中找到 http:/gdbwww.gdb.org物物 理理 图图 谱谱 构构 建建 的的 步步 骤骤q确定各STS序列及其在基因组中的位置q大插入片段基因组文库的构建（BAC文库）q 以特定STS为标记筛 选并定位克隆q含有STS的克隆在基因组中排序基因组数据库（GDB）中至少含有24568个STS路标信息关关 于于 文文 库库作为载体的基本要求能在宿主细胞中进行独立的复制 具有多克隆位点，可插入外源 DNA片段 有合适的筛选标记，如抗药性 大小合适，易于分离纯化 拷贝数多 文库的概念 含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体 载体：能携带外源DNA进入宿主细胞的工具，常用的载体有质粒载体、噬菌体载体、细菌人工染色体等宿主：能容纳外源DNA片段的生物体，常用的有大肠杆菌、酵母等BACBAC文库的构建文库的构建NotI、SacI脉冲场凝胶电泳得200Kb左右的大片段DNA纯化后与载体连接电转化，将连接产物导入大肠杆菌感受态细胞插有外源DNA片段的BAC载体在含有氯霉素的固体培养基中培养每一个菌落为带有相同外源DNA片段的单克隆BAC克隆的筛选“STS-PCR反应池”方案筛选种子克隆特定的STS标记相互间具有重叠片段的BAC克隆根据STS信息组装成contig，并定位于基因组上Contig每一个菌落为带有相同外源DNA片段的单克隆Regional mappingRegional mappingMinimaltilingpathselectedforsequencing.Regional mappingBeijing Map共48个每组 8 个每8个96孔板组成1个。