荧光蛋白表达ppt课件文档.ppt

荧光蛋白表达课件背景介绍绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白GFPGFP增强型增强型GFP（EGFP）野生型野生型GFPGFP折叠易受温度影响，发光较弱，并折叠易受温度影响，发光较弱，并且在某些细胞中不表达，因此人们运用定点突且在某些细胞中不表达，因此人们运用定点突变等技术对野生型变等技术对野生型GFPGFP进行了改造目前应用进行了改造目前应用较为广泛的是增强型较为广泛的是增强型GFPGFP（EGFPEGFP），它是将），它是将Ser65Ser65用用ThrThr替代，替代，Phe64Phe64用用LeuLeu替代，使替代，使GFPGFP的荧的荧光强度提高了光强度提高了3535倍，而且激发后倍，而且激发后1624h1624h后仍可后仍可稳定地检测到荧光稳定地检测到荧光GFP的荧光性质及应用优点(1)易于检测，灵敏度高2)荧光性质稳定3)对细胞无毒害4)构建载体方便5)可直接用于活细胞测定6)不受假阳性干扰7)广谱性8)易于得到突变体EGFPEGFP氨基酸序列氨基酸序列由Prasher等成功克隆出了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一级结构氨基酸序列：MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDH MVLLEFVTAAGITLGMDELYK。

绿色荧光蛋白(GFP)的发现极大地推动了现代生物学的发展，应用前景广阔GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物等方面基于新型功能荧光蛋白(如光激活荧光蛋白和光转换荧光蛋白和氧化还原敏感的GFP等)的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间GFP用途n1、作为转基因植物和动物的筛选标记n2、GFP在分子生物学研究中的应用l2.1 在生物学研究中的应用l2.2 在生态学上的应用l2.3 在医学研究中的应用1、作为转基因植物和动物的筛选标记 分子标记：分子标记：作为一种新型的报告基因，GFP已在生物学的许多研究领域得到应用利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签(protein tagging)，即利用DNA重组术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察GFP的相对分子质量小，能与多种不同的蛋白质N端或C端融合而保持其天然蛋白质的特性，可特异地进行蛋白质及细胞器的地位研究大量实验表明，GFP可定位到细胞核、细胞骨架、叶绿体、线粒体等细胞器中。

另外、将GFP作为活细胞内蛋白质的标记分子，利用荧光共振能量转移显微技术可以研究细胞内的蛋白质之间的相互作用2.1 在生物学研究中的应用GFPGFP可以作为标记分子，可以作为标记分子，目前已被广泛应用于基因标记、蛋白质标记、环境微生物研究、寄生虫学研究以及发育生物学研究中基因表达模式的探索等方面，成为活细胞分子水平研究的工具目前生物农药的杀虫效果往往得不到准确评估，而利用GFP标记，通过荧光观察可以避免评估杀虫剂杀虫效果时仅仅记录有典型感染症状的害虫个体，而忽视无明显感染症状但确实已经感染或正在感染的害虫个体，同时无需进行分子生物学鉴定即可方便地区分杀虫剂致死和天然病原致死，从而客观准确地评客观准确地评价杀虫剂的毒力价杀虫剂的毒力2.2在生态学上的应用GFPGFP在生态学中的应用在生态学中的应用将GFP基因直接导入目标生物或将GFP基因克隆到病毒、细菌或质粒上，通过它们的介导而间接标记目标生物，进行生态学规律研究用用GFPGFP基因标记遗传工程微生物以监测其在水环境中的存活和去向基因标记遗传工程微生物以监测其在水环境中的存活和去向朱应等构建了带GFP基因的重组棉铃虫病毒该病毒一次感染棉铃虫后不再重复感染，室内饲养3代，各代均可见典型的发绿色荧光的棉铃虫，表明病毒可以介导GFP标记其宿主，预计将为研究棉铃虫的迁飞和暴发规律提供强有力的手段。

跟踪观察微生物跟踪观察微生物传统方法中，一般用荧光染料标记微生物，由于微生物的分裂，燃料被稀释，因此长期以来未能观察到微生物侵入活细胞的实时动态过程GFP基因能克服上述的缺点，且在活细胞中能直接观察到无需破坏原有细胞而阻止感染的继续进行2.3在医学研究中的应用在组织工程的种子细胞研究中在组织工程的种子细胞研究中，有学者利用GFP示踪证实了脂肪来源的干细胞的分化方向和分化能力；利用增强型GFP筛选合适的生物材料，如发现最合适的构建气管软骨的细胞来源是肋软骨细胞GFPGFP还用于细胞因子作用的研究还用于细胞因子作用的研究，如发现血小板衍生生长因子的持续表达可以延缓成牙骨质细胞的钙化过程；以及活体动态观察的研究，为脊柱和椎间盘等部位的细胞治疗或基因治疗后的随访建立了新研究方法在药学研究中，在药学研究中，用GFP对目的物进行标记，分析目的物在细胞中的变化情况，如酶分子分布状态、生物活性、受体、离子通道等变化，从而从众多的化合物中筛选出与体内信号分子功能相似“潜力”化合物，这样的方法简便易行因此，GFP成为了药物筛选及药物作用机制研究中的有力工具在眼科中，在眼科中，许多视网膜疾病如视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、增生性玻璃体视网膜病变、糖尿病视网膜病变等由于遗传缺陷或基因表达异常等导致视网膜神经细胞某些蛋白质结构异常、代谢紊乱或促进与抑制新生血管形成因子表达，从而严重危害视力。

GFP也广泛应用于视网膜的基因转移系统、目的基因的调控及感光细胞凋亡保护的研究在免疫学治疗方面，在免疫学治疗方面，应用GFP作为表皮生长因子受体研究的工具，并对第二信使蛋白进行亚细胞定位，这不仅可以揭示其在活细胞内作用，还可以观察一些抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂等信号传导抑制药物的作用效应红色荧光蛋白红色荧光蛋白RFPRFP红色荧光蛋白的来源 1999 1999 年年,Matz,Matz 等从印度洋等从印度洋2 2太平洋地区的太平洋地区的珊瑚虫中分离出珊瑚虫中分离出6 6 种与绿色荧光蛋白种与绿色荧光蛋白(green(green fluorescent proteins,GFP)fluorescent proteins,GFP)同源的荧光蛋白同源的荧光蛋白,并鉴定了它们的光谱性质其中来源于并鉴定了它们的光谱性质其中来源于Discosoma sp.Discosoma sp.红色荧光蛋白红色荧光蛋白(drFP583)(drFP583)在紫在紫外线的照射下可发射红色荧光外线的照射下可发射红色荧光,其最大吸收其最大吸收波长为波长为558 nm,558 nm,最大发射波长为最大发射波长为583 nm583 nm。

其发射波长较长其发射波长较长,灵敏度与信噪比均比灵敏度与信噪比均比GFP GFP 高高,为基于为基于GFP GFP 的体内研究提供了一个很好的体内研究提供了一个很好的互补工具的互补工具红色荧光蛋白的演变 drFP583 具有自身的缺点,如寡聚化、成熟过程缓慢和对细胞有毒性等限制了它的应用因此,人们对其进行各种修饰和改进,以得到不同发光特性、不同聚集状态及适于不同细胞的突变体最先进行突变实验的是drFP583,而Clontech 公司已将它的一个低毒、低寡聚化及成熟快的突变体E572NA 商业化,商品名为DsRed DsRed第二代DsRed，即大家所熟知的DsRed2DsRed2，它的多肽氨基末端已经进行了一些突变改造，这样就可以使组织蛋白凝 集和降低毒性在第三代DsRed的突变体中，成熟时间 更短，荧光强度也增强红色荧光蛋白序列红色荧光蛋白的应用 红色荧光蛋白极大的丰富了细胞内或体红色荧光蛋白极大的丰富了细胞内或体内光学成像的荧光探针，使其能够与生物体内多内光学成像的荧光探针，使其能够与生物体内多种物质联合，实现对生物体内生命物质活动的监种物质联合，实现对生物体内生命物质活动的监视，红色荧光蛋白在继绿色荧光蛋白后，在某种视，红色荧光蛋白在继绿色荧光蛋白后，在某种定义下可以说是革新了生物学研究定义下可以说是革新了生物学研究运用红色运用红色荧光蛋白可以检测到细胞的活动，可以标记表达荧光蛋白可以检测到细胞的活动，可以标记表达蛋白，可以进行深入的蛋白质组学实验等。

特别蛋白，可以进行深入的蛋白质组学实验等特别是在癌症的研究过程中，由于红色荧光蛋白的出是在癌症的研究过程中，由于红色荧光蛋白的出现使得科学家们能够观测到肿瘤细胞的具体活动，现使得科学家们能够观测到肿瘤细胞的具体活动，比如肿瘤细胞的成长、入侵、转移和新生等，应比如肿瘤细胞的成长、入侵、转移和新生等，应用前景广泛用前景广泛红色荧光蛋白的应用 在活细胞及动物全身成像中需要在活细胞及动物全身成像中需要表现较好的红色荧光蛋白，主要是由于在表现较好的红色荧光蛋白，主要是由于在多种颜色成像实验中需要红色探针，另外多种颜色成像实验中需要红色探针，另外基于较长的激发波长产生的光毒性较小，基于较长的激发波长产生的光毒性较小，可以用来探测较深的生物组织可以用来探测较深的生物组织黄色荧光蛋白黄色荧光蛋白YFPYFP 黄色荧光蛋白（黄色荧光蛋白（Yellow Fluorescent Yellow Fluorescent Protein Protein，YFPYFP）可以看做）可以看做GFPGFP一种突变一种突变体，最初来源于维多利亚多管水母（体，最初来源于维多利亚多管水母（Aequorea victoriaAequorea victoria）。

相对于绿色荧光蛋）相对于绿色荧光蛋白，其荧光向红色光谱偏移，而这主要白，其荧光向红色光谱偏移，而这主要是由于蛋白是由于蛋白203203位苏氨酸变为酪氨酸其位苏氨酸变为酪氨酸其最大激发波长为最大激发波长为514 nm514 nm，最大发射波长，最大发射波长为为527 nm527 nmYFP序列 1 atgaagttcg ttgtacgggc cctgaccgcg accgccgtgg cggcggcggt cgccgccctc 61 gccggatgct cggcgacctc gccggccccc ggctccgccg agggctcctc agcggggacg 121 aagctcgtcg tctacacgcc gcagggcgac cccgtgcgcg ggggctacat caccaagcac 181 gccaaatcgg acctcggcct ggacgtaaag ctggtcaacg gggcgggcgg agatctcgcc 241 acccgcctca tcgccgagaa gaacaacccg caggcggacg tcgtcgtcgt cctcggggca 301 ccgcagctca accggatcga ccaggcgggt gtgctccagc ctttcgctcc agactgggcc 361 ggcaagatcc cgtccgcctt cgcgtccgga agcaaggact tcacactgct gacgcagacc 421 ccgatcgcga tcgcctacaa cgcgtccacg atgacggcgg cccaggcgcc gagcagttgg 481 acggacctgg ccaagccgga gtacaaggac aagttcgcct tcccggccct caccagccag 541 acgggccagg cggcagccgt gggaatcctg tggcgctacg ccgatcacac gaccggcacg 601 gtgtcgcaga 。