菘蓝叶片离体培养及植株再生.doc

耘蓝叶片的离体培养及植株再生姓名：学号：指导老师：倪苏刘帆专业：学院：农学院2013 年 7 月茯蓝叶片的离体培养及植株再生摘要：以惡蓝幼嫩叶片为外植体，探讨了不同外源激素种类、组合及其不同浓 度对惡蓝叶片丛生芽诱导的影响，并完成了植株再生结果表明，在MS培养基 的基础上添加6-BA+NAA都能成功诱导出丛生芽；但当添加激素为2,4—D+KT 时则不能诱导丛生芽，且在加入6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L时长势最好，为最 佳诱导出芽培养基，并在添加MS+NAA1.0mg/L的生根培养基中长出不定根 关键词：蘇蓝；叶片离体培养；植株再生茯蓝（皿心indigotica Fort.）是十字花科茯蓝属二年生草本植物⑴，具干燥的根 入药称作板蓝根，具有清热解毒、凉血利咽Z功效，用丁治疗盛丰感冒、发热、 头痛、咽喉肿痛、扁桃体炎、急性腮腺炎、咳嗽痰多等多种生呼吸道感染疾病⑵, 其叶片（大青叶）具有抗菌和清热解毒的功效⑶，是常见的大宗药材，具有重耍的 经济价值为满足药材市场对大量和优质的茯蓝需求以及育种工作需求，茯蓝的 组培快繁技术体系显得尤为重耍，关于其组培快繁已有不少报道⑷叫木试验的 研究在前人的基础上优选了松蓝叶片离体培养基，旨在为低成本、快速高效的植 株种苗生产提供技术前提，同时也为松蓝的优质育种、转基因及遗传研究等研究 T作奠定基础。

1材料与方法1.1供试材料 耘蓝幼叶（由四川农业大学农学院植物生理学系提供）1.2试验方法1.2.1培养基设计培养基设计如下：所有培养基均附加琼脂5g/L、蔗糖30g/L,并调整PH至5.8,其中生根培养 基另外加入0.2%的活性炭，每500mL培养基分装于42支试管或10个玻璃瓶中， 试管分成7支/包棉塞封口，捆扎，玻璃瓶用封口膜封口，培养基需耍在高压蒸 汽灭菌锅中121 C高温湿热灭菌20分钟后放至常温下备用诱导培养基见表1,继代培养基选择诱导培养中长势最好的一组；生根培养基设计见表2.表1不同激索组合诱导培养基序号不同激素组合诱导培养基1MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1 mg/L2MS+6・BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L3MS+6-BA2.0mg/L+NAAl .Omg/L4MS+2,4・D 1.0mg/L+KT0.5mg/L5MS+2,4・D2.0mg/L+KT0.5mg/L6MS+2,4-D4.0mg/L+KT0.5mg/L表2不同激素组合生根培养基序号不同激素组合生根培养基1MS+NAA O」mg/L2MS+IBA 0」mg/L1.2.2材料处理茯蓝植株提前一天喷施多菌灵800倍液预消莓，试验时剪下健康的先用洗涤 剂漂洗后将叶片置丁纱布中流水冲洗30min,再用75%酒精消毒l()s,无菌水冲 洗2〜3次后，用0.1%升汞消壽8min,再用无菌水冲洗5〜6次。

1.2.3接种在超净工作台上讲松蓝叶片切割成约lcn?大小的小片，并用灭菌的滤纸吸 干叶片表而多余的水分，用灭好菌的银子将叶片块正而向下接种到试管中，每管 一小块1.2.4诱导培养及数据记录接种好的叶片暗培养7天，Z后光培养，并每7天记录各指标(见表3), 叶片放在20C下培养，每天光照12h,强度约1500〜20001X1.2.5继代光培养7天后选长势最好的培养基继代培养；从试管中取出从生芽并切分成 小块的单个的芽，接种到玻璃瓶中，每瓶4株，在同条件下继续培养1.2.6生根培养及炼苗移栽继代培养7天后按表2的生根培养基设置接入培养生根，长出完整根系的无 菌苗拿到常温下炼苗3〜5天后，揭开封口膜再炼苗3天左右，自来水洗净苗上的培养基，移栽至土壤中移栽时苗床应喷施多菌灵80()倍稀释液或稀高镒酸钾溶液对苗床和幼苗消毒2结果与分析 2.1不同激素组合对耘蓝诱导培养的影响叶片接种后一周观察记录的指标如表3所示，在光培养条件下培养7天后，各组 耘蓝叶片分化效果如图1所示表3暗培养7天后不同培养基组合启动效果观察统计表序号接种 数/个污染数/个 真菌/细菌污竦真菌滓/%细菌存活 数/个存活率 /%叶片形态变化个/个134000034100%叶卷曲变小，增 厚，有芽点23500003085. 7%出芽，叶密集，卷 曲，高度2-3cm34200004198%膨大，卷曲42700002696. 3%膨大，增厚，卷曲537000037100%膨大，卷曲62700002696. 3%膨大，增厚图1光培养7天后各组培养基中赵蓝叶片情况图1中从右至左分别是1〜6组培养基，其中1~3组有丛生芽分化，4~6组无 从生芽的分化，但多少都形成了愈伤组织，而3号培养基中芽分化最多，叶片长 而纤细，2号培养基数量适中但叶片较宽而短，1号培养基生长状况明显不如2、 3号。

就总体而言，考虑到壮苗及形成在上植株，2号培养基的激素组合最优继代培养时，总共接种丛生芽123株，壮苗结束后存活120株，其中有1 株细菌污染，未存活的苗呈现玻璃化，分析可能是由于转接时灭菌的银子未完全 冷却烫伤无菌苗使其玻璃化2.2不同激素对耘蓝生根培养的影响生根培养7天后，只有接入1号培养基的少量芽长岀零星不定根，即加入 NAA的培养基有根的分化，2号培养基中没有根的分化即加入IBA的培养基还 没有根的分化，且部分死亡分析可能的原因是NAA能较好的促进松蓝丛生芽 生根，并完成植株再生，但也不排除由丁试验操作的原因导致了从生芽的死亡以 及培养时间不够植株还没有开始分化根，需要进一步加长时间培养观察但由于 时间限制，未能完成移栽试验3结论与讨论3.1结论试压数据统计结果表明，在MS培养基的基础上添加6-BA+NAA都能成功诱导 出从生芽；但当添加激素为2,4—D+KT时则不能诱导从生芽，且在加入 6-BA2. 0mg/L+NAA0. 5mg/L吋长势最好，为最佳诱导出芽培养基，并在添加 MS+NAA1. Omg/L的生根培养基中长出不定根，炼苗后移栽成活可完成植株再生， 但由于时间限制未能完成移栽试验并统计成活率，只能初步证明共植株再生是能 够成功的。

3.2讨论由试验结果可知，不同类型的外源激素对松蓝叶片的诱导效果是不一样的2,4-D+KT的组合诱导离体叶片脱分化形成愈伤组织，而6-BA+NAA的组合则诱 导离体叶片再分化形成丛生芽；而不同的外源激素共同存在的情况下，不同的浓 度比则对从生芽的分化影响程度不同，随着NAA浓度的增加，从生芽的数量在 增加，BA的相对浓度开始减小，促进细胞的分裂增殖的能力自然减小，生长素 类似物N AA的作用开始凸现出来，因此丛生芽的叶片会呈现长而纤细的状态 分裂素与生长素比值低时，叶组织薄壁细胞回复分裂能力，促进不定根和侧根的 分化，相反其比值高时促进不定芽的分化参考文献[I]姚振生.药用植物学[M].北京:中国中医药出版社,2003:266⑵ 金玉松板蓝根的新用途[J]•开卷有益•求医问药,2003(5):32-33[3] 陈秋芳，黄群策,秦广雍.赵蓝叶片离体培养与试管无性系的建立[J].河南农业 科学 2007(7):98-100[4] 张丽琼，周琼，柳林，等•不同培养基对茯蓝叶片组织培养的效应[J].广西热带农 业,2007(6):30-31[5] 彭丽萍，张远兵,汪露润.松蓝离体叶片高频再生系的建立[J].安徽科技学院学 报,2007,21(4):14-17[6] 苗永美，简兴，石静•茯蓝两种外植体愈伤组织诱导研究[J].生物技术通报， 2008(1):147-150致谢在两位老师的悉心教导下，经过这一学期的课程学习，我对植物组织培养技 术有了初步的认识，并切实感受到收获良多，在此对两位老师表示由衷的感谢， 老师辛苦了！另外还要感谢在此课程中一起协同合作完成实验的各位同学和研究 生师兄们，正是因为大家共同努力才顺利的完成了这门课程的学习，谢谢！。