实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定教学教材.ppt

实验中的注意事项：1、实验的取材2、操作及观察3、实验数据的处理4、实验结果的分析：分清错误和误差5、思考题6、实验报告*2单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式实验四叶绿素的提取、理化性质和含量测定（p130136） 一、叶绿素的提取 二、叶绿素的理化性质 三、叶绿素含量的测定1. 实验目的1）掌握叶绿素的提取及其含量测定的方法2）了解叶绿素的理化性质2.1 用含水的有机溶剂提取叶绿素 亲水的卟啉环的“头部”: 镁原子居于卟啉环的中央，带正电性，与其相联的氮原子则偏向于带负电性，因而卟啉具有极性，是亲水的，可以与蛋白质结合 亲脂的叶绿醇的“尾巴”: 叶醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶绿素的脂溶性2.2 叶绿素的物理性质2.2.1 吸收光谱2.2.2 荧光现象2.2.3 含量测定2.2.1 叶绿素的吸收光谱 2.2.2 2.2.2 荧光现象荧光现象透射光下反射光下 叶绿体吸收光后，激发了捕光色素蛋白复合体（LHC），LHC将其能量传递到PSII或PSI其间所吸收的光能有所损失，大约3%-9%的所吸收的光能被重新发射出来，其波长较长,也即叶绿素荧光 。

叶绿素溶液在透射光下呈绿色，在反射光下呈红色的现象分子吸收的光能有一部分消耗于分子内部的振动上，发射的荧光的波长总是比被吸收光的波长要长叶绿素吸收红光后处于第一单线态，叶绿素分子要从第一单线态返回基态所发射的光称为荧光2.2.3 含量测定 叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别位于663nm和645nm； 叶绿素a、b在652nm处有相同的比吸收系数（34.5），测OD652求出叶绿素a、b总量 故叶绿素浓度COD652/34.5(mg/ml) 叶绿素的含量（mg/g）=叶绿素的浓度提取液体积稀释倍数/样品鲜重2.3 叶绿素的化学性质2.3.1 叶绿素的结构2.3.2 取代反应2.3.3 皂化反应2.3.1 叶绿素的结构 叶绿素a与b很相似，不同之处仅在于Chla第二个吡咯环上的一个甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代即Chlb2.3.2 取代反应 2.3.2.1 稀酸 去镁 铜代 2.3.2.2 浓酸 去镁 水解卟啉环中的Mg处于不稳定的状态，可被H+、Cu2+ 、Zn2+等离子取代 2.3.2.1 稀酸 叶绿素溶液与稀酸(如:草酸)作用，H+取代Mg后的产物为褐色的去镁叶绿素； 去镁叶绿素与Cu2+ 或Zn2+作用， Cu2+ 等离子取代后的产物为深绿色的铜代叶绿素等；2.3.2.2 浓酸 叶绿素溶液与浓酸(如:盐酸)作用，除了代换Mg外，可使去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并形成褐绿色的去镁叶绿酸。

叶绿素去镁叶绿素铜代叶绿素（稳定而不易降解，常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本）2.3.3 皂化反应 叶绿酸是二羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被叶绿醇酯化叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应 叶绿素与碱皂化形成的叶绿素盐能溶于水，极性增大皂化分层 叶绿素的盐形成以后，因分子极性增大，易溶于稀酒精溶液中，不能进入苯层； 而类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中 一部分苯分散在水中形成乳胶体，出现一层乳白色的溶液 低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层3 材料、试剂与配备1 材料 菠菜叶片2 仪器设备 研钵，漏斗，剪刀，试管，试管夹，容量瓶(25ml,50ml)，分光光度计，水浴锅等3 试剂 95%乙醇，苯，浓盐酸，36%乙酸， CuSO4， MgCO3，石英砂4 实验步骤4.1 叶绿素的提取4.2 叶绿素的物理性质 透射光颜色 反射光颜色4.3 叶绿素含量的测定4.4 叶绿素的化学性质 取代反应 皂化反应4.1叶绿素的提取1. 新鲜菠菜叶片，去掉中脉后的样品称重( 约2-3g,记录样品重量)；2. 剪碎入研钵中，加少量石英砂和碳酸镁粉及2-3 ml的95%乙醇，研磨匀浆，再加乙醇混匀；3. 过滤到25 ml容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣，最后连同残渣一起过滤（ 直至滤纸和残渣中无绿色为止）最后用乙醇定容至25ml(后称原液)，摇匀。

4.2 叶绿素的荧光 取3 ml叶绿素提取原液，观察其透射光、反射光下的颜色；4.3叶绿素含量的测定 取5 ml叶绿素提取原液移入至50 ml容量瓶， 95%乙醇定容(稀释液) 以95%乙醇作为空白对照，测OD652 叶绿素浓度: COD652 / 34.5 ( mg/ml ) 叶绿素的含量（mg/g）= 叶绿素的浓度提取液体积稀释倍数/样品鲜重4.4 叶绿素的化学性质4.4.1 取代反应4.4.1.1 稀酸： 取3 ml叶绿素原液，一滴滴加入醋酸(先快后慢)，观察并记录颜色变化； 向上述加醋酸后发生颜色变化的溶液中加少量CuAc颗粒，65水浴加热，观察并记录其颜色变化4.4.1.2 浓酸 取3 ml叶绿素溶液，一滴滴缓慢加入浓盐酸，观察并记录颜色变化4.4.2 皂化反应 取3 ml叶绿素提取原液，加1 ml 20% NaOH-甲醇溶液，摇匀， 65水浴5 min； 取出冷却后，先加3 ml苯，后加3 ml水（沿壁慢慢加入），轻轻摇匀，静置观察其分层现象5 结果记录与数据处理 颜色变化/分层 原 理荧光现象取代反应醋酸 CuAc 浓HCl皂化反应上层 中层 下层表1 叶绿素的理化性质5.1 实验现象记录与分析5.2 叶绿素含量计算与分析 叶绿素浓度: COD652 / 34.5 ( mg/ml ) 叶绿素的含量（mg/g）=叶绿素的浓度提取液体积稀释倍数/样品鲜重以样品重为3g为例:=C（2550/5）/3=OD652/（34.53）（2550/5）6 注意事项 操作应在弱光下进行 ？ 研磨时间尽可能短，以不超过2分钟为宜 分光光度计的正确使用(更换波长后要调0) 皂化反应最后做 在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白絮状物，溶液浑浊，且不分层。

可激烈摇匀，放在3040的水浴中加热，溶液很快分层，絮状物消失，溶液变得清澈透明7 思考题1 提取叶绿素时为何要加入MgCO3？2 为何选用652 nm 测叶绿素的含量？3 解释皂化反应的分层现象实验五 硝酸还原酶活性的测定（p124127）。