高老师开题报告初稿.docx

内蒙古农业大学博士学位论文开题报告题目：粗纤维日粮条件下驱除原虫和真菌对绵羊瘤胃微生物种群及纤维降解的影响博士生：高爱武导 师：侯先志 教授专 业：动物营养与饲料科学研究方向：反刍动物营养1、引言反刍动物是粗饲料的主要利用者，纤维物质主要在瘤胃内通过瘤胃微生物的作用被 降解、消化瘤胃微生物主要由细菌、原虫和厌氧真菌组成瘤胃微生态作为生物界最 复杂、最有应用研究价值的生态系统之一，一直是营养学和微生物学家进行深入研究的 对象国际上从二十世纪中期就开始了此方面的工作，我国在此方面的研究始于 70 年 代，但直到目前为止，瘤胃微生物对纤维物质的降解机理及各微生物种群之间的相互关 系仍然不是很清楚1.1 瘤胃微生物对纤维物质的降解作用在正常饲养条件下，瘤胃细菌数量在109-lOio/ml,原虫数量在105-106/ml,真菌游 动抱子数在 103-105/ml 之间（Theodorou 等，1990）原虫约占到瘤胃微生物总生物量的一半，其中主要是纤毛虫，极少数为鞭毛虫从 瘤胃中驱除原虫，将在很大程度上改变瘤胃的发酵功能过去几十年内，虽然对原虫在 纤维物质降解过程中的作用进行了许多研究，但它们真正的影响还存在争论（ Ushida 等， 1991）。

大量体内、体外实验表明，纤毛虫直接参与植物细胞壁的降解同时，从 贫毛属的纤毛虫内也分离到了具有降解纤维素、半纤维素和果胶的酶类（Orpin，1984） 纤毛虫对植物细胞壁组织的降解首先是从有破损的部位开始的，降解的程度与纤毛虫的 种类及植物的种类都有关系一般认为，一些大型的内毛属及双毛属纤毛虫可以穿透并 利用植物细胞壁，它们被证明具有纤维降解活性，而一些小的内毛虫和全毛虫却不具有 此活性，这使得原虫在分解纤维中的作用仍然有争论目前，有关原虫所分泌的纤维降 解酶及其在植物细胞壁降解中作用的研究远落后于细菌和真菌，在此方面还有待于继续 进行深入研究瘤胃细菌因其在数量上的绝对优势和代谢途径的多样性，被认为在纤维物质降解中起主要作用其中，白色瘤胃球菌(R. albus)、黄色瘤胃球菌(R. flavefaciens )、 及产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)是主要的纤维分解细菌前两者可 以产生大量的纤维素酶复合酶体，其中主要为木聚糖酶产琥珀酸丝状杆菌则产生大量 的多糖酶，但该菌不能降解木聚糖瘤胃内的厌氧真菌的发现较晚，直到1975年才首次被证实存在于反刍动物瘤胃内， 因此对瘤胃厌氧真菌的分类一直没有完善的标准。

目前通用的分类方法将瘤胃厌氧真菌 归属于真菌界鞭毛亚门的壶菌纲(Chytridiomyces)，共计有Neocallimastix、 Piromyces、Anaeromyce、Orpinomyces、Caecomyces 和 Cyllamyces 六个属瘤胃厌氧 真菌中的绝大部分种属都能分解纤维素，都具有广泛的高活性的降解植物细胞壁的纤维 素酶、木聚糖酶、果胶酶和酯酶(Orpin等，1997)而且，体外进行的厌氧真菌与纤 维分解细菌的比较表明，真菌在降解大片段的植物组织时，显著优于纤维分解细菌 (Joblin 等， 1989)细菌和原虫通常黏附于植物的气孔、皮孔或饲料的破损边缘，而 真菌在消化中除集中在上述部位外，以丰富的假根系统刺穿植物表皮，进一步为细菌提 供黏附位点，提高纤维物质降解率(Akin, 1994; Joblin,1989)瘤胃厌氧真菌降解植 物的能力因种属而异，一般认为 Neocallimastix 属和 Piromyces 属降解秸秆的能力较 强，而 Caecomyces 相对于其它各属降解植物细胞壁的能力最弱(冯仰廉， 2004)，原 因可能与 Caecomyces 缺乏丰富的假根体系、不能穿透植物深层的组织有关。

1.2 瘤胃微生物在纤维降解中的相互作用众多的研究表明，在瘤胃内纤维降解过程中，细菌、原虫及厌氧真菌之间存在复杂 的互作关系，既有协同作用，又有相互竞争作用瘤胃原虫、细菌及真菌都可分泌纤维 素酶和半纤维素酶，但它们在纤维物质降解过程中的贡献及相互作用还知之甚少1.2.1 瘤胃厌氧真菌与原虫的相互作用研究表明，原虫吞食细菌，对细菌的种群有很大影响因此，有理由认为原虫也很 可能影响到瘤胃内真菌的种群虽然还没有直接的证据表明原虫捕食真菌，但实验已证 实当原虫被驱除后，瘤胃内真菌的游动孢子增加了几倍（ Orpin 等，1977）在纤维降 解过程中，原虫和真菌都是附着于植物组织的破损部位的，而真菌的游动孢子的大小与 一些细菌相似，这也许造成了原虫对真菌游动孢子的捕食利用纯化的多糖作为底物的 体外研究显示，内毛虫显著抑制真菌的生长和纤维水解能力，但全毛虫对真菌的纤维水 解几乎没有什么影响（fonty, 1991 ）瘤胃原虫 Polyplastron multivesiculatum、 Eudiplodunium maggii、Entodinium 或混合原虫具有溶解厌氧真菌 Piromyces 菌体组 织的能力。

Morgavi等的研究表明，原虫具有几丁质酶活性（Morgavi, 1994）然而， 当原虫与厌氧真菌N.prtriciarum以水稻秸秆细胞壁为底物共同培养时，却发现真菌的 活性没有受到明显影响（Widyastuti，1995）也有作者认为瘤胃内的真菌并不受原虫 的影响有些实验结果发现驱除原虫后瘤胃内真菌的游动孢子或是出现了上升，或是出 现了下降（Romulo，1987； Romulo， 1989； Williams， 1991）这些实验结果表明，原 虫与真菌的相互关系的研究还存在着不明确的方面但这些结果在某种程度上说明原虫 具有影响瘤胃内厌氧真菌生长的能力1.2.2 瘤胃厌氧真菌与纤维分解细菌的相互作用 瘤胃细菌与真菌的相互作用一直是研究的热点一般认为，在纤维降解过程中，两类菌 群可能存在互补作用，即真菌能够对植物片段进行彻底的侵蚀，把大片段植物颗粒分解 为小的片段，为瘤胃细菌提供更多的作用位点而细菌只对植物的表面进行侵蚀正是 这种互补关系，使厌氧真菌能够以一定的比例与细菌共存于竞争激烈的瘤胃生态环境 内同时，很多研究表明，白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌对真菌的纤维分解活性有抑制 作用，也有研究认为，黄色瘤胃球菌对真菌的抑制是可变的，其不总是抑制真菌对纤维素的降解。

产琥珀酸丝状杆菌对真菌没有抑制作用（Ryoji, 1997）,而且，产琥珀酸丝 状杆菌与 C.communis 的共同培养显示，二者具有协同作用，可以提高纤维的降解 （Bernalier 等， 1992）一些其它纤维分解细菌同样对真菌降解纤维有影响分解果 胶的 L.multiparus 菌和分解木聚糖的 P.ruminicola 菌对 N.frontalis 的纤维分解能力 没有什么影响，但分解木聚糖的 B.fibrisolvens 对真菌活性却有强的抑制作用，其可 以极强地抑制六种真菌的纤维降解（Joblin，1994）瘤胃球菌对厌氧真菌具有不同影 响效果的原因目前还不清楚，这可能与菌株及其作用底物的类型有关目前，已有许多 有关上述微生物分泌酶系及编码基因的研究最近的研究也表明，瘤胃真菌具有抑制一些纤维分解细菌降解活性的能力相关研 究表明，N.frontalis和P.communis产生的胞外因子抑制黄色瘤胃球菌对木聚糖的降解 （Joblin， 1996）1.2.3 瘤胃原虫与纤维分解细菌的相互作用 瘤胃原虫可以吞食细菌，被吞食的细菌可能是原虫合成蛋白质及核酸的主要来源，也可 能是其脂肪合成的前体。

细菌也广泛利用原虫分解生成的蛋白质和支链淀粉（ Cottle 等， 1994）有研究显示，全部驱除原虫后，细菌数量显著增加，但纤维分解菌的数量 变化不大有关原虫对细菌影响的体内研究并不多见，原虫对于纤维分解细菌浓度的影 响还不清楚1.3 分子生物学方法在瘤胃微生态研究中的应用瘤胃微生物是严格厌氧的，由于传统研究方法的局限性，使得对瘤胃微生物的定量 研究变得十分困难通常，瘤胃细菌和真菌种群的计数方法为Hungate（1969）发明的 厌氧滚管计数法和最大可能计数法这些方法依赖于培养基对瘤胃微生物的培养能力， 且耗时、耗力、工作量大即便如此，专家预测也仅有1%—10%的微生物能被培养（Amann等，1995）最近，分子生物学技术已经应用于瘤胃微生物（Odenyo等，1994； Krause 等， 1996； Gordon， 2000； McSweeney， 2005； Tajima， 2001），基于 16SrRNA 的核苷酸 探针技术和荧光定量PCR技术已在国外被用于瘤胃微生物的定量检测，但国内还未见有 相关报导因此，为了更好的研究瘤胃微生物种群的相互关系，结合传统方法和分子生 物学方法进行研究，将有助于进一步了解瘤胃微生态错综复杂的关系。

2、立题依据有关瘤胃内微生物对纤维物质降解作用的研究虽然进行了许多，但许多研究是在体 外进行的，而且是利用纯培养或几个菌株进行的实验，并不能代表瘤胃内真实的微生态 环境，因此，实验结果有一定的局限性因此，有必要进一步利用体内实验阐明的瘤胃 内微生物在纤维物质降解中的相互作用许多实验通过驱除原虫以研究原虫对瘤胃发酵的影响，这也是研究原虫对瘤胃细菌 及真菌影响的有效方法反刍动物去原虫并不引起瘤胃消化的显著变化，但是可以影响 瘤胃细菌和真菌的种群和数量，进而影响纤维物质的降解反刍动物瘤胃去真菌的研究很少仅有的一些实验结果也存在矛盾显然，驱除瘤 胃厌氧真菌对瘤胃细菌及原虫的影响还不清楚上述结果的不确定，一方面与实验日粮 种类有关，另一方面，厌氧真菌计数方法的差异可能是导致这些研究结果不一致的主要 原因基于分子生物学技术在瘤胃微生物研究中的应用，非常有必要将传统方法和分子 生物学方法结合起来进行研究3、本研究的目的阐明粗纤维日粮条件下，分别驱除原虫和厌氧真菌对瘤胃内纤维物质降解的影响；定量研究分别驱除原虫和厌氧真菌对其它瘤胃微生物的影响， 同时测定不同瘤胃 微生物区系变化与瘤胃微生态系统功能间的关系；比较荧光定量PCR技术与传统的厌氧微生物培养法的差异;通过驱除后重新引入原虫和真菌的方法，进一步验证原虫和瘤胃厌氧真菌在纤维降 解中的作用及与其它瘤胃微生物的关系。

4、研究内容本研究共分四个部分进行，具体内容如下： 试验一、驱除原虫对绵羊瘤胃微生物种群及纤维物质降解的影响（1） 试验目的： 采用部分驱除原虫和全部驱除原虫对照的方法，研究原虫对粗纤维日粮条件下绵羊瘤胃微生物种群及纤维物质降解的影响2） 试验动物和日粮：试验动物：选用9 只开有瘤胃瘘管的蒙古绵羊，随机分为三组，每组3 只，其中一 组全部驱除原虫，一组部分驱除原虫，一组作为对照组日粮：采用 1.2 倍维持的饲养水平，粗料为青干草，精料为混合精料，精粗比为2： 8饲养管理：每天于07：00 和 19：00各喂一次粗料和精料，自由饮水预饲期为15 天，正式试验期为 20 天从预饲期开始，每天在饲喂精料的同时通过瘤胃瘘管直接投 入驱原虫剂（全驱组4g/头，部分驱除组2g/头），驱原虫剂采用十二烷基苯黄酸钠 3）试验方法：在预饲期投入驱原虫剂的当天开始，每天于 10：00采集瘤胃液，进行原虫计数（直 接镜检，不用染色液固定），当全驱组原虫全部消失，部分驱除组原虫数量基本恒定时 可以进入正式试验期在整个试验期内，对原虫进行随机抽查，以确保其数量恒定采样时间：在正式试验期内，每天于早上喂后 2h（ 09：00）， 4h（ 11：00）， 8h（ 14：00）, 12h （17： 00）, 14h （19： 00）采集瘤胃液，连续采样三天，进行瘤胃微生物、瘤 胃内环境指标。