高效实时检测单个活细胞1受肾上腺素刺激后的1AAR运动.pdf

1 实时检测单个活细胞1 受肾上腺素刺激后的 1AAR 运动Xu Ning1*,Liang Zhangyi2*,Xu Ming1,Guan Yinghua2,He Qihua3,Han Qide1,Zhao Xinsheng2*,Zhang Youyi1*1 血管医学研究所，北京大学第三医院，并重点分子心血管科学，教育，北京，中国（100083）教育部重点实验室2 国家实验室北京分子科学，结构的动态与稳态化学国家重点实验室，化学生物学和化学与分子工程学院，北京大学，北京，中国（100871）3 医学分析中心，北京大学，健康科学中心，北京，中国（100083）E-mail： 摘要目的：调查运动的1A-肾上腺素受体（1AARs）的激动剂苯肾上腺素（PE）和受体的动态与毫秒，在活细胞中第一个实时活动中激发方法：标记 1AARs使用单克隆抗体和Cy3共轭山羊抗鼠IgG，记录了他们在 theliving HEK293A由激动剂苯肾上腺素（PE）刺激细胞运输过程中的轨迹，然后分析了它们的动态特性结果：1A 的具体检测，对市民生活HEK293A 表面-1A 条，敷设 PE内在的刺激下后，刺激细胞与 PE 1A 型细胞二十分钟刺激了PE，明显的合作关系定位为 1A 至敷设，并发现架 F-肌动蛋白。

40 后的 PE，在 HEK293A 近似直线运动轨迹分刺激-1A 型细胞记录，而且他们计算速度结论：特定标记活细胞表面的方法，提供实时的表面行为实时检测手段方便通过这种方法，我们能够明确地发现第 1A ARS，记录与 50ms 的暴露在单个活细胞的实时时间行为的受体单个粒子关键词：肾上腺素能受体;轨道;活细胞绪言膜受体往往发挥的生理和大量关键作用病理生理条件这些受体的治疗药物的大量目标可视化和跟踪激动剂刺激受体在活细胞，将有助于了解分子机理受体激活但是，使用传统的生化技术是很难调查，实时单个活细胞受体的运动，因此它是不够的受体调控的研究未来的研究，研究了受体贩卖动态特性，不仅将加强在受体细胞功能的理解，而且将有利于为新型药物的设计和改进对广大受体一系列相关待遇的条件高节奏实时显微镜分辨率相信是在努力造成很大影响，了解蛋白质的功能1最近，一个或几个分子检测技术已经在生命科学研究方面取得迅速进展这些技术使我们能够记录实时单个粒子的行为2,3由于受体的脱敏和内部已在实时成像研究生活在一分钟时间分辨率4细胞，现在的挑战是调查受体运动实时或迅速发生在单个活细胞的活动与动态毫秒的决议1本 工 作 由 国 家 自 然 科 学 基 金（20333010，30490172）和NKBRSF（G1999075305）资助。

对于这个目标，一个良好的标记方法和检测方法是非常重要的名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页，共 9 页 -2 1-肾上腺素受体国集团成员蛋白偶联受体（G 蛋白偶联受体）的家庭1-ARS 发挥调解收缩，心脏和血管平滑肌细胞生长反应5 了重要作用独特的 3个基因编码受体亚型，第 1A-，1B 至，和 1D-ARS，已经被克隆和药理特点 6根据过去的调查，第1A 受体表达不仅在细胞表面，而且在细胞质7然后，我们标记由一种单克隆抗体标志使用杀伤和Cy3-共轭山羊抗鼠 IgG（Cy3 免疫球蛋白）-1A 型ARS，并记录了高节奏的使用高分辨率荧光成像技术对他们的运输过程中的轨迹刺激受体激动剂肾上腺素（PE）使用这种方法，我们能够明确地发现并记录表面受体的受体与50ms 的单个粒子暴露在单一活细胞的实时时间的行为我们先取得1A 的轨迹，敷设内部的实时分析激动剂刺激了它的动力特性，而不是由经典生化技术或扫描分在这项研究中，我们已经制定了标记活细胞表面的受体和跟踪高节奏的使用高分辨率荧光成像技术在单个活细胞的内在受体的方法这种方法可以提供对机制和受体运输动态特性研究的一些新的见解钟的时间分辨率激光共聚焦显微镜的使用探讨。

材料与方法细胞培养，转染，并选择稳定表达细胞FLAG 标记的 1A在 pDoubleTrouble 载体（1A-AR/pDT）机场铁路是由热心提供 PE 明尼曼教授肯尼思（Emory 大学，美国）人类胚胎肾 293A 细胞（引领 293A）的传播，但有 10（5/5）胎儿在 37牛血清，5CO2 的环境中培养液（Invitrogen 公司）2000 年转用脂质体转染试剂（Invitrogen 公司）根据制造商的建议，细胞转染1A-24 每小时铁构造细胞稳定表达1A受体被选定的 800 微克/毫升经 G418（Sigma）中 1a表达和受体的放射配体结合化验确定为如前所述 8HEK293A-1A细胞在细胞密度为 105 镀/毫升，就coverships保持在培养基，10为 1-2 天前实验胎牛血清活细胞标记的Cy3 偶联山羊抗鼠IgG 活细胞孵育 3710 分钟 抗-FLAG单克隆抗体（12.5g/ml;Sigma）和 Cy3-共轭山羊抗鼠IgG（Cy3-IgG 抗体，3.75g/ml;染料/蛋白 3.9;Jackson ImmunoResearch）顺序前荧光实验，细胞的PBS 缓冲液（pH 7.4）洗 3 次。

钙反应为了检测 HEK293A 的聚乙烯反应 1A细胞，荧光-3（分子探针公司）是用来表明用 PE 钙信号增加细胞的培养基中培养4 微米荧光-3 在 37，60 分钟前实验洗涤后用PBS 3次，观察细胞的免疫荧光显微镜10 微米聚乙烯加入作为PE 脉冲，同时从荧光荧光-3 检测该显微镜系统是用来测量荧光-3 荧光这是一样的外延荧光成像，和 488 nm 激光束（型号 163C 条，光谱物理），40 目标（北美=0.6，尼康）和一个分色镜（505nm 长通，色度技术）被选中通过一个五十零分之五百三十五荧光发射波长带通滤波器是由同一CCD 所采集药物治疗名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 2 页，共 9 页 -3 研究1A-AR在 PE 的刺激下，细胞培养中等 10 微米聚乙烯（Sigma）为实验前 20 分钟内PE 的浓度保持在整个细胞培养实验或 PE 加入观察期间的文化瞬时免疫荧光生活 HEK293A-1A细胞培养在 3710 分钟反旗单克隆抗 体（12.5微 克/毫 升;Sigma）和 FITC偶 联 山 羊 抗 鼠IgG（杰 克 逊ImmunoResearch）顺序然后，细胞的培养基中培养10 微米聚乙烯（Sigma）20 分钟细胞。

在此之后，细胞固定为15 4多聚甲醛的 PBS 分和 0.2透性海卫-100用 PBS 洗涤后，细胞培养与鬼笔标记的鬼笔环肽（Sigma 为 25 分钟），然后在 Vectashield 清洗和安装图片被收购利用激光共聚焦扫描显微镜激光共聚焦显微镜对样品进行了光谱成像的物理与激光扫描共焦显微镜计划，载脂蛋白油浸60 倍物镜（莱卡，Wetzlar，德国）用于收集图像的软件是徕卡TCS 的 NT 版本 1.6.587这些照片被送到一家减少与Adobe Photoshop 4.0（Adobe 系统，加州 Mountain View）分析的计算机关于激光设置是恒定的所有实验然而，无论荧光和鬼笔数字信号，通过调整提高光电倍增管（PMT）光电倍增管初步的调整使我们能够最大限度地减少背景信号的同时，最大限度地感兴趣的荧光信号外延荧光成像细胞兴奋的 532 纳米激光束（千禧非法入境者，光谱物理），它是反映样本由分色镜（575nm 长通，色度技术）从 Cy3 荧光发射是由一个100 客观收集（北美=1.40，石油，尼康）装在一个倒置荧光显微镜（TE300，尼康）通过四十 分之六百五纳米带通滤波器或长通565 纳米过滤器（色度技术）的散射光被冻结，Cy3 荧光图像背部照亮，帧转移CCD（级联 512B，罗佩尔科学取得）。

通过使用的 CCD，帧速率只有部分得到提高，同时我们成功地测定高品质的专业服务公司（点扩展函数在50 毫秒时间分辨率）图像采集，存储和显示的执行使用 MetaView 软件（通用影像公司）和WinView32 软件（罗珀科学）整个观察，在室温下进行图像分析每个中 1a肾上腺素受体复合物和标记抗体形成衍射极限的形象每个像素点的数据，至少由一个二维高斯函数拟合广场以获取精确度小于10 nm 10 中心值9整个装置是通过一个用户定义的Matlab 程序（MathWorks 的公司）数据分析与统计所有数据都为平均值 扫描电镜至少3 个人的实验与手段比较表演，使用名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 3 页，共 9 页 -4 SPSS 软件 t 检验结果1A-ARS 特别标记的活细胞表面中 1a具体的检测，对市民生活HEK293A 表面氩 1A细胞从而实现了其主要的单克隆抗体和Cy3 使用免疫球蛋白（图1A）每个中 1a肾上腺素受体复合物和标记抗体形成衍射极限的形象个别地区则是在中1a肾上腺素受体复杂的图像和标识细胞表面抗体，每一个点可能包含不只是一个1A受体在相同的亮度，初级抗体和非特异性吸附Cy3-IgG 的 HEK293A 细胞（图 1B）及无主抗体，Cy3 非特异性吸收抗体在HEK293A-1A细胞（图 1C）非常低。

不同的荧光强度的直方图，如图所示是一维，初级抗体和Cy3 非特异性吸附，跻身中 1a-ARS 初级标记抗体和 Cy3 在生活 HEK293A IgG 的 1A细胞特别（红色），IgG 的 HEK293A 细胞（蓝色）和无主抗体，Cy3 非特异性吸收抗体在 HEK293A-1A细胞（绿色）（图 1D）因此，通过这种方法，我们可以专门标签的受体活细胞表面图 1（甲）外膜荧光显微镜显示1A 的荧光图像标记特别初级抗体和 Cy3-IgG 的生活 HEK293A-1A 细胞乙）HEK293A 细胞被选为对照样本初级抗体和Cy3 非特异性吸附抗体很低c）无主抗体，Cy3 非特异性吸收抗体非常低HEK293A-1A细胞四）不同的荧光强度的直方图中的 1A，专用标记初级抗体和Cy3-IgG 抗体在活 HEK293A-1A细胞（红色），初级抗体和 Cy3 非特异性吸附在 HEK293A 细胞抗体（蓝色）和无主要抗体，Cy3 非特异性吸收抗体在HEK293A-1A 细胞（绿色）对于外延形象，荧光显微镜，比例尺=5 微米与抗体标记不影响活动的1A 受体要检查后，抗体中1a标记的生物活性ARS，10 微米聚乙烯被添加到标记HEK293A-1A细胞诱导钙的反应是由荧光显示-3（图 2A）。

两种钙瞬态特性，钙瞬变幅度+增加（表现为一种荧光比例/背景荧光，F/F0）和钙的速度+瞬态upstroke 上升（为每相对荧光强度变化带来的第二，友通），获得了从最初的荧光时间的推移，3 全细胞荧光增加独立实验测定三次分别与每帧20 毫秒的曝光时间在 F/F0 标记细胞为 1.86 0.15，而细胞的无标记为1.83 0.07（平均值 扫描电镜）标记的细胞和未标记细胞钻石是1.70 0.41 和 1.88 0.26（平均值 SEM）也分别（图 2B）这些数据表明，与抗体标记不影响活动的1A 受体名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 4 页，共 9 页 -5 图 2 （一）荧光-3 作为钙的指标，表明了10 微米 PE 钙反应钙反应的标记细胞之间的连贯性和控制支持，与抗体标记不损害第1A 受体的活动也没有在活细胞内钙的反应 HEK293A 没有第 1A 受体这些数字显示出三个独立的实验比例尺=5 微米乙）+钙瞬变幅度增加（F/F0）的标记细胞为 1.86 0.15，与未标记细胞 F/F0 为 1.83 0.07（平均值 扫描电镜）在每秒（钻石相对荧光强度的变化标记细胞）是1.70 0.41 和 1.88 0.26（平均值 教统局局长）的未标记细胞。

1A-ARS 内部受激动剂PE 刺激下随着外在荧光标记方法，我们使。