对高压冷冻技术的应用探究(精).doc

对高压冷冻技术的应用探究1高压冷冻高压冷冻是在2. 1X 108Pa压力下对生物样品进行冷冻固定，在此压力下，允许样品在一定的冷冻速度范围内得以充分地冷冻，而且冷冻样品的厚度可达600 Am[19]0冷冻过程实际上是使细胞内的水由液体转变为固体的过程在此过程中，水的体积增大，而2. 1X 108Pa的高压明显地抑制这一膨胀过程，使得通过改变水的物理特性从而抑制冰晶的形成这一变化减少了由于水结冰而产生的热量，实际上也就减少了单位时间内所需冷却的热量，因此也就降低了获得满意冷冻效果所需的冷冻速度[21]样品有效冷冻厚度的增加，使得冷冻技术为生物结构的研究创造了更多的机会2高压冷冻仪细胞暴露在高压下自然会受到损伤[23],而且压力越大，暴露时间越长，所受的损伤越严重[19] o因此要防止压力对样品的损伤，必须设计出合理的仪器，使得细胞在冷冻之前能经受瞬间的高压Moor及其同事经过20余年的努力已发展出适用于生物组织和细胞学研究用的高压冷冻仪 BalzerHPMOlO (BalzersCorporation, Hudson, NH) [19, 20,25] o高压冷冻仪利用液氮做为冷冻剂和升压剂，以便当100ml液氮在0. 5s内通过直径为013mm的小孔进入样品室时能够保持2. 1X 108Pa的压力，而且温度和压力几乎在30ms内同时达到173K和2. lX108Pa.这种同步过程主要是通过在液氮进入样品室之前直接注入少量热异丙醇做为升压介质来实现。

当压力产生时，大约0. 2ml的异丙醇首先进入样品室，接着液氮才能进行样品的冷却此系统能够在冷冻之前产生和保持充分的压力并且同时保证仅仅在极短时间(30ms)对样品产生压力[19] o高压冷冻仪尽管操作简单，可靠和迅速，但由于价格昂贵，目前仅有30余台分布欧美及日本的少数实验室3高压冷冻植物样品的制备理想的样品制备是将生活在自然状态的植物样品进行直接固定，如 单细胞藻类或薄层培养的植物组织细胞但是大多数植物样品必须经过 分割使之成为高压冷冻所要求大小的组织块因此样品的制备必须精心 操作，尽量保持组织细胞的完整性否则便会由于操作不当，使组织细 胞在分割过程中遭到破坏或改变其超微结构细节植物细胞由于具有相当厚的细胞壁和大液泡，因而给冷冻固定带来 诸多不便厚的细胞壁阻碍冷冻剂的迅速渗入，同时含有大量水分的液 泡常常因得不到彻底冷冻而形成冰晶[5, 22]因此，植物材料应根据 不同组织的细胞结构特点，样品厚度W200Am为宜植物样品的常规制备方法是利用解剖刀或刀片切取适当厚度的组织薄片，并分割成适合于冷冻的大小通常从分割到冷冻至少需要5〜6min,加之手工操作不可避免地对样品产生机械损伤，从而引起组织或细胞结构在固定前发生明显的变化，以致使所得的结果与自然状态相差甚远。

Mtlller实验室推荐使用一种特制的手动切片刀，其固定部分由厚度调节器和夹物部位组成，活动部分由刀片和夹刀部分组成，整个切片过程类似于简单的滑走切片机首先用手动切片刀制取200 Am厚度的组织片，再用直径2mm的打孔器制取样品圆片，将圆片放入盛有12hexadecene溶剂的Eppendorf试管中，在较缓和的真空条件下抽气，然后将样品转移至内径为2mm,深度为200 Am的圆形铝盘中，并用12hexadecene填充盘内的剩余空间，再用另一平底的圆形铝盘盖严最后将铝盘连同样品一起放入样品夹中，插入高压冷冻机进行冷冻固定整个样品制备过程简单迅速，时间可缩短至2〜3min. 4高压冷冻技术在植物细胞超微结构研究中的应用高压冷冻技术在植物细胞超微结构中的应用，按其研究内容大致分 为两类：一类利用植物为材料进行高压冷冻技术本身的研究和发展，另 一类则以高压冷冻技术为手段来探讨结构植物学研究中的一些问题应用高压冷冻技术对不同植物细胞进行研究并和常规化学固定方 法比较，可以充分说明高压冷冻技术的优越性Kaneko和Walther利 用高压冷冻技术和常规化学固定方法对萌发的豌豆幼叶进行了超微结 构的比较研究，结果显示：经高压冷冻固定的样品，细胞膜光滑无皱褶, 细胞器非常饱满，细胞质和细胞器基质均匀浓厚，高尔基体潴泡清晰， 同时微丝束频繁可见。

同样，在发菜(Nostocflagell辻orme)营养细 胞的超微结构研究中也证实，经高压冷冻固定和冷冻置换制备的发菜营 养细胞，胶质鞘与细胞结合紧密，细胞壁分层清晰，细胞质膜平滑，内 膜结构饱满，而应用常规化学方法，胶质鞘严重收缩，细胞内膜结构呈 弯曲的线条状()［27］Galway等［28］认为高压冷冻固定的植物细胞 其细胞膜光滑并且紧贴细胞壁，细胞器也都光滑饱满在对Nicotiana 和Arabidopsis根尖细胞超微结构的比较研究中［29］,经高压冷冻固定 的组织细胞除具上述特征外，所有的内膜系统都很光滑，而且边缘覆盖 着薄层细胞质质膜紧贴细胞壁液泡并不显示空腔状，而是充满电子 致密物质微管数量多且直，相互之间具有连桥，高尔基体附近具大量 的小泡分布此外，在Petunia和Brassica卵细胞及胚囊细胞的超微 结构研究中也显示细胞质膜光滑并且紧贴细胞壁，细胞器表面光滑，轮 廓清楚，质体及线粒体显示清晰的内部结构，高尔基体具有规则的含不 同内容物的槽库，分泌泡则分布在其成熟面［30］ o细胞内部如此生动而 充实的景象，充分说明高压冷冻技术能更好地保存植物细胞的超微结 构，并使其接近于自然状态［31］。

利用高压冷冻技术对不同植物叶，根 尖以及根瘤组织的研究已经取得了成功的经验［32］而Michel等［33, 34］利用高压冷冻的苹果幼叶为材料进行的冷冻超薄切片则取得了开创 性的成果样品制备和分析的过程中没有常规方法中常用的化学固定， 脱水，包埋和染色等过程，使得样品制备过程中人为的和化学的污染机 会大大降低冷冻超薄切片所显示清晰的超微结构更接近反映样品在生 活时的状态，为进一步探索其他不同材料的冷冻超薄切片技术打下了坚 实的基础随后，经高压冷冻后发菜藻体的冷冻超薄切片的成功再一次 证明利用高压冷冻技术进行冷冻超薄切片对研究细胞的超微结构有着 更重要的意义其结果进一步证实了高压冷冻和低温转换的发菜超微结 构研究的可靠性［27］ o这些都为更广泛深入地利用高压冷冻技术研究植 物结构和功能的统一奠定了基础由于冷冻技术在结构植物学的应用上 具有一定的难度，人们总是有意无意地选择化学固定方法，而对其所引 起的假象视而不见但高压冷冻技术在结构植物学研究中取得的成功， 极大地刺激了植物学家们对高压冷冻技术的兴趣Craig和Staehelin［35］首先利用高压冷冻技术研究豌豆和玉米根 尖细胞的超微结构，惊喜地发现内质网和核膜外膜之间是通过高度收缩 的管状膜相连接（直径约为30nm） o他们认为这些狭窄的连接管能使 两种膜系统保持各自的同一性，即使有丝分裂期间核膜破毁，两者仍能 进行各自的功能活动。

另外他们结合冷冻断裂复型技术，还发现在独特 的内质网潴泡边缘具有大量的小泡存在2年后，Lishtsheidl等［36］ 利用高压冷冻技术在Drosera触毛表皮细胞结构上所获的结果则更为 诱人他们发现表皮细胞中普遍存在微丝一内质网复合体,它们与质膜, 液泡膜，细胞核，线粒体，叶绿体以及微体紧密相关并在免疫标记的 基础上证实复合体在皮层细胞中也十分显着在此区域管状内质网占据 着中间位置，通过它与质膜和肌动蛋白微丝紧密连接他们认为皮层细 胞质中靠近质膜的内质网分子可以起到稳定肌动蛋白微丝的作用，并为 微丝提供了可靠的场所用以抵抗细胞质流动所形成的力与此同时， Staehelin等［37］在以前工作的基础上，对Nicotiana和Arabidopsis 根尖细胞中高尔基体槽库大分子分化进行了更为深入而细致的工作由 于冷冻技术特有的固定效果，使他们有幸捕获到普遍存在于高尔基体槽 库中的一些全新结构特征：同一高尔基体不同潴泡之间具有明显的结构 差异，如形成面潴泡（cis）具有较宽的内腔，着色浅；中央潴泡则相 对较窄，并充满染色较深的产物；分泌面（trans）大部分在中央区域 具有完全萎缩腔，在横切面上形成4〜6微米宽的黑线。

不同根尖细胞 高尔基槽库具有不同的形态特征在中柱细胞和周围细胞中高尔基潴泡 之间的结构(intercisternaeelement)仅位于分泌面潴泡间而在分 生组织细胞中则缺乏这种结构在较老的周围细胞中仅仅分泌面展现出 与粘液相关的染色另外，利用冷冻断裂技术显示出在具潴泡间结构的高尔基槽库在其 分泌面潴泡膜内具有平行排列的冷冻断裂颗粒他们指出潴泡间的结构 是包括多糖粘液分子合成在内的，酶复合体的储存场所其功能是阻止 由于特大粘液分子的作用使复合体参与形成分泌泡Ding等［38, 39］ 应用高压冷冻和低温置换技术制备的烟草根尖及叶细胞结构中显示了 微丝的分布与行为，并且首次从超微水平角度报道了在烟草 (NicotianatabacumL. var. Marylandmammoth)根冠细胞的 PPB(preprophasebands)中具有微丝在比较高压冷冻和丙烷喷射固定技 术之后，Ding等［40］认为高压冷冻固定的质量明显高于丙烷喷射冷冻 固定细胞内所有细胞器包括微管，单微丝及与微管相连的微丝均显示 清晰的结构，而丙烷喷射固定的样品中微丝束具有松散的结构，很可能 是一种污染由于采用了冷冻固定和免疫细胞化学方法，细胞结构的固 定效果大大改进。

从而导致高等植物细胞分裂中细胞板形成的新模式 ［8］由于高压冷冻固定具有固定速度快，能够捕获一些瞬间完成的生 理过程(如胞饮和胞吐过程)的特点［41, 42］,使得在拟南芥花蜜腺的 超微结构研究中发现高尔基分泌泡在向细胞外的分泌过程中并不与细 胞质膜发生融合，而与传统的"胞吐〃假说不同［6］ oWu和Muller在对欧洲赤松(Pinussylvestris)树脂道细胞超微 结构研究中，发现树脂不仅以传统方式分泌，还可通过质膜通道分泌的 全新途径完成［43］在植物病理学领域，Studer及同事［44］利用高压 冷冻技术在大豆根瘤超微结构研究中所获得的结果，更为直观地揭示出 结构与功能的关系根瘤是植物和固氮菌共生的场所，大多数植物的中 央根瘤区细胞都被类菌体所感染细胞溶质（cytosol）充满单个或成 群存在的类菌体，它们都由周围类菌体膜所包围类菌体无论进行呼吸 代谢还是固氮都需要氧气，氧气消耗呼吸链就位于类菌体质膜上然而 传统的化学固定方法显示出在类菌体和周围类菌体膜间具有很大的空 间，如此大的空间很难使氧气扩散到类菌体上，而利用高压冷冻技术发 现根瘤细胞溶质中类菌体被类菌体膜紧密包裹这一结构特征即周围类 菌体膜与类菌体紧密接触，是与氧气和营养物质从植物细胞质或周围类 菌体膜向类菌体转移的生理功能相一致。

两种固定方法为何引起如此大 的差异，主要原因是高压冷冻技术避免了化学固定液逐步渗透的问题 植物细胞溶质的流动性和微生物在瞬间被停止，所有成分均固定在原始 位置，因此保证了良好的结构保存，以致于具有共生体的植物细胞显示 出类菌体与周围类菌体膜紧密相连利用同样方法，Cermola等［45］在 普通大豆中再次证实相同结构特征的存在此外，Mendgen小组的研究 人员从1988年以来运用高压冷冻和低温置换以及免疫标记电镜技术研 究寄生植物和寄生菌的超微结构，包括膜结构，分泌系统及其寄主和寄 生菌之间的相互作用时细胞壁物质的运输和定位等，作了很细致的工 作，取得了满意的效果［46〜51］综上所述，高压冷冻技术能够很好地应用于植物组织和细胞结构的 研究，由于它具有冷冻迅速和将细胞成分同时固定两大特点，因此能够 捕获最接近于自然状态的结构特。