RNA浓度测定(紫外光吸收法).docx

RNA 浓度测定（紫外光吸收法）一、 实验目的1. 了解紫外吸收法测定 RNA 浓度的原理2. 熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法二、 实验原理 核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统 （—C = C 一 C = C 一），能够强烈吸收250~280nm波长的紫外光核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm处遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外 光吸收值的变化来测定RNA物质的含量在不同 pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之 表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同所以，在测定核酸物 质时均应在固定的 pH 溶液中进行三、 实验器材1. UV-9100 型紫外可见分光光度计2. 容量瓶 100ml（*1）3. 试管 1.5cm*15cm（*9）4. 吸管四、 实验试剂1. 酵母 RNA2. 标准RNA试剂（100微克每毫升）3. NaOH 溶液五、 实验步骤1. RNA粗品的制备称取8g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%NaOH溶液40ml，沸水浴加热 30min,经常搅拌冷却，然后4000r|min离心15分钟。

取上清液，加入95% 酸性乙醇40ml，边加边搅加毕，静置5-10min离心滤液先用95%乙醇洗2 次，继而用无水乙醇洗2 次，洗涤时可用细玻璃棒小心搅动沉淀乙醇滤 干后，滤渣即为粗 RNA2. 样品的处理：称取0.2~0.25g粗品RNA，加2ml0.2%NaOH和1ml H2O溶解，调成糊状，再 加入40~50mlH20,溶解，调PH至7.0,后定容至100ml（再取2ml定容至100ml 待测，此过程重复三次）3. 标准曲线的绘制取六支试管，编号，按表加入试剂六、作表作图入:260nmRNA m:0.2133g试管123456ABC标准RNA(ML)012345蒸馏水(ml)1098765RNA浓 度 |ig|ml01020304050吸光度0.0000.2320.4330.6270.8170.9810.5190.5230.522样品 RNA 质量为 25.3|ig|mlx50x100ml=0.1265g样品 RNA 纯度：0.1265宁0.2133=59.3%七、误差分析1. 根据理论在5~45yg|ml与吸光值成正比，而该范围的两个端点没有取到，六号试管RNA浓度已经超出了范围，不能作为曲线的参考值。

2. 因为是做了三次平行试验，所以在样品三次定容时可能有些许误差3. 在配置标准RNA浓度时可能导致RNA浓度有些许的误差4. 样品中可能含有少量蛋白质,DNA,对紫外光也有强吸收作用会产生误差八、思考题1．采用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点？用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，具有简单、快速、灵敏度高的优点，并且待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质，产生较小测定误 差但该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时，则会产生较大测 定误差，需要设法事先除去2．若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正？ 当样品中含有核苷酸类杂质时，需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂处理，沉淀除去大 分子核酸，测定上清液 260 nm 处光密度，以此作为对照；再从未加沉淀剂测得 的样品液 260nm 光密度中扣除。