丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备.ppt

任务一、SHMT的电泳制备方案的制定樊贝贝第二组生药111120114231051、概念 中文简称：“丝氨酸羟甲基转移酶” 　　英文名称： Serine hydroxymethyltransferase 简介：它是酶促制备L-丝氨酸的关键酶，在四氢叶酸(THFA)、甲醛及磷酸吡哆醛(PLP)存在下催化甘氨酸生成L-丝氨酸它的生理学功能是催化丝氨酸和甘氨酸之间可逆的互换一、知识链接一、知识链接2、电泳方法根据支持物的不同，可以分为纸电泳，薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等3、酶工程领域中采用较多的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）4、影响电泳的因素： 电泳介质的PH值， 缓冲液的离子强度， 电场强度， 电渗现象5、SHMT在光合组织中的生理作用 （1） 光合作用组织中线粒体GDC／SHMT系统在Gly和Ser分解中起着重要作用（2） SHMT在非光合组织中的生理作用（3)SHMT在根瘤碳流动中的作用（4）光呼吸SHMT影响植物对生物和非生物胁迫的抵抗能力6、、SHMT的分离制备的方法电泳法（如：聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳)定义：定义：利用溶液中带有不同量的电荷的阳离子或阴离子，在外加电场中以不同的迁移速度向电极移动，而达到分离目的的分析方法7、电泳作用：用于分离蛋白质和寡核苷酸。

作用原理： 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应 8、电泳形式： （1）非变性聚丙烯酰胺凝胶 （2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE） 非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开 垂直板电泳槽示意图垂直板电泳槽示意图加样加样l聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳该凝胶由丙烯酰胺Acr和交联剂N，N—甲叉双丙烯聚酰胺Bis聚合而成聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质lAcr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种二、实训原理二、实训原理l化学法的引发剂是过硫酸胺Ap催化剂是四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸胺，在紫外光照射下引发自由基团采用不同浓度的Acr、Bis 、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶因此可按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度1、试剂l 分离胶缓冲液（TrisTris-HCL-HCL缓冲液 PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。

l浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mLl电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:称取Tris 6g, 甘氨酸28.8g, 用无离子水溶解后定容至1L用时稀释10倍l 30％Acr－Bis贮存液：30g Acr,0.8g Bis, 用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱 lTEM10%过硫酸铵（新鲜配制）；25%蔗糖溶液；0.05%溴酚蓝溶液；7%冰乙酸溶液l染色液：称取考马斯亮蓝R250 2.5g，冰乙酸92ml，甲醇454ml，加去离子水454 ml使其完全溶解，过滤ED；后置棕色瓶保存l脱色液：取甲醇50ml，冰乙酸75ml，加蒸馏水至1000ml 2、材料 SHMT标准蛋白质3、器材： 垂直板型电泳槽、天平、 直流稳压电源、 50或100μl微量注射器、 玻璃板、水浴锅、 染色槽、 烧杯、吸量管 胶头滴管1 1、、 安装垂直板电泳槽安装垂直板电泳槽 （1） 将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠； （2） 用手将两块玻璃板夹住放入电泳槽内，玻璃室凹面朝外，插入斜插板；． （3) 用蒸馏水试验封口处是否漏水。

2 2、制备凝胶板、制备凝胶板 （1） 分离胶制备： 取Acr-Bis储备液 5.0mL, Tris-HCl缓冲液 PH8.9 2.5mL, 去离子水12.39mL, TEMED 0.02mL置于小烧杯中混匀，再加入10% 0.1mL过硫酸胺，用磁力搅拌器充分混匀2min混合后的凝胶溶液，用细长头的吸管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约 1cm  用吸管在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸馏水（约3－4cm），用于隔绝空气，使胶面平整 分离胶凝固后，可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限倒掉重蒸水，用滤纸吸去多余的水 （2） 浓缩胶制备： 取Acr-Bis储备液1.0mL， Tris-HCl 缓冲液（PH6.7）1.25mL，TEMED 0.01mL, 去离子水7.64mL，10% 过硫酸胺0.1mL，用磁力搅拌器充分混匀 混合均匀后用细长头的吸管将凝胶溶液加到长短玻璃板的窄缝内（及分离胶上方），距短玻璃板上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板待浓缩胶凝固后，轻轻取出样品模槽板  用手夹住两块玻璃板，上提斜插板，使其松开，然后取下玻璃胶室去掉密封用胶框，用1%电泳缓冲液琼脂胶密封底部，再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽。

插入斜插板，将电泳缓冲液加至内槽玻璃凹口以上，外槽缓冲液加到距平玻璃上沿3mm处 3、加样、加样 （1) 各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.5~1mg/mL，沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用 (2) 一般加样体积为10－15μL（即2－10μg蛋白质）如样品较稀，可增加加样体积 (3)用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳4、电泳、电泳 （1）将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10mA待样品进入分离较时，将电流调至20－30mA （2）当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色 5、染色、染色 将凝胶放入考马斯亮蓝R250染色液中，使染色液没过胶板，染色30min左右6、脱色、脱色 弃去染色液，将凝胶置于脱色液中，并经常更换脱色液，直至背景蓝色褪去如用50℃水浴或脱色摇床，则可缩短脱色时间脱色液经活性炭脱色后，可反复使用。

(1) Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩，纯化应在通风橱内进行2) 玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡3) 样品槽模板梳齿应平整光滑4) 用琼脂封底及灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过五、注意事项五、注意事项 (5) 切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲6）为防止电泳后区带拖尾，样品中盐离子强度应尽量低，含盐量高的样品可用透析法或凝胶过滤法脱盐7）电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果谢谢观看谢谢观看。