酵母培养中的基质代谢、呼吸和生长的参数检测与参数相关分析-2011版.doc

酵母培养中的基质代谢、呼吸和生长的酵母培养中的基质代谢、呼吸和生长的参数检测与参数相关分析参数检测与参数相关分析培养基：酵母粉，蛋白胨，葡萄糖，甘油，培养基：酵母粉，蛋白胨，葡萄糖，甘油，pH5.5 仪器：葡萄糖测定仪仪器：葡萄糖测定仪 其它：电子秤、摇瓶、量筒、烧杯若干其它：电子秤、摇瓶、量筒、烧杯若干 菌种：酵母菌菌种：酵母菌酵母培养中的基质代谢、呼吸和生长的酵母培养中的基质代谢、呼吸和生长的参数检测与参数相关分析参数检测与参数相关分析一、实验目的一、实验目的 微生物的生长受到自身代谢特性和环境的影响，比如在不同的介质中同一种菌的代谢 特性和代谢速率会不一样，不同的生长阶段菌的代谢也会不同在分批培养中，随着微生 物的生长，基质被利用，代谢产物的积累，环境会发生变化，从而对微生物代谢产生影响 所以测定代谢过程的参数，如菌浓度、基质浓度、pH、溶氧溶度等，并对这些参数的时序 变化进行分析并进行动力学分析，可以使人们对微生物培养过程有一个量化的了解，所以 检测代谢参数是过程控制与优化的基本前提，其中基质代谢、氧的消耗对于菌体生长密切 相关 本实验力图使学生掌握测定菌体浓度、基质消耗、呼吸相关的各种参数的方法，以及 学会分析这些参数的时序变化和相互间的关系。

一种参数可以有不同的检测方法，本实验将选取在实际应用中比较常见的检测项目， 使学生通过实验能掌握常用参数的测定方法并且将即时测定的数据进行时序分析和多参 数的关联分析使学生对代谢的网络化有一个初步的认识二、实验原理二、实验原理 本实验在 15L 发酵罐中进行酵母培养在需氧代谢中，菌体生长是以基质代谢和氧的 消耗为基础的，因为它们提供了生长所需要的前体物质和能量，而且从基质和氧的消耗也 可以反映菌生长的状况和阶段酵母的生长以葡萄糖为碳源，随着葡萄糖的利用酵母生长， 同时也会产生代谢副产物……小分子酸，因此要用 NaOH 调节 pHNaOH 消耗的多少与糖 代谢相关分批发酵中，酵母生长会出现延迟期、对数生长期、稳定期、衰亡期等阶段， 我们通过测定菌量也可以了解三、材料与方法三、材料与方法 3.1 种子培养基配方 酵母粉 1%，蛋白胨 2%，葡萄糖 2%，pH5.53.2 发酵培养基配方 酵母粉 1%，蛋白胨 2%，葡萄糖 2%，甘油 2%，pH5.53.3 补糖配方 葡萄糖 30%3.4 葡萄糖测定 按葡萄糖测定仪的说明书操作3.5 电极标定 3.5.1 pH 电极标定 将 pH 电极连上电极线，将罐发酵 pH 电极标定控制屏幕上的斜率和截距分布设置为 1 和 0；将电极插入 pH6.86（称为标 1）的标准缓冲液，等 pH 显示的读数稳定后读取读数 （称为测 1） 。

拿出电极，用去离子水冲洗电极，并用卷筒纸轻轻的吸干电极头上的水，然后插入 pH4.00（称为标 2）的标准缓冲液，等 pH 显示的读数稳定后读取读数（称为测 2） 电极的斜率由式 2 计算得到：(式 2)2121 测测标标电极斜率在发酵罐的控制屏幕上输入斜率，再把电极插入 pH6.86 标准溶液中看 pH 读数与标准 缓冲液值的差距，调节截距，使读数等于标准缓冲液值这时的截距就是标定的截距3.5.2 溶氧电极的标定 将罐发酵溶氧电极标定控制屏幕上的斜率和截距分别设置为 1 和０；在培养基灭菌温 度达到 115℃时，调节显示屏上的斜率读数使溶氧读数为零这时的斜率读数即为标定的 斜率接种结束后发酵开始时，调节截距使溶氧读数在 80%左右，这时的截距为标定的截 距四、实验内容四、实验内容 4.1 OD600与菌体干重的关系 酵母是单细胞生物，它在液体中呈单个悬浮状，因此可以通过测定发酵液的光密度来 得知菌生长量由于发酵液略显黄色，因此选择的波长要对黄色光吸收尽量的少，本实验 选择 600nm具体方法如下： 取 10ml 发酵液，冷冻离心转速 10000 转/分钟，离心 10 分钟，弃去上清液，得到湿菌 体，在 95℃干燥箱干燥 12 小时，称取干重。

计算得到 OD600 与菌体干重的关系4.2 基质代谢和菌体生长的关系 4.2.1 种子培养基的配制及种子培养 (1)种子培养基的配制 按照材料与方法中的种子培养基配方，配制成 1200ml 培养基，并用盐酸调好 pH，分 装到 11 个 500ml 的摇瓶中每瓶 100ml，用松棉塞塞住瓶口，并用牛皮纸包扎好瓶口放入 高压灭菌锅 115℃，灭菌 15 分钟 (2)接种 在超净工作台上用无菌接种针挑取一针斜面菌种，接入已灭菌的种子培养基，包扎好 瓶口,每接种一瓶种子须换一根接种针，以免染菌 (3)种子培养 放入 30℃摇床培养，转速 230-240 转/分钟，培养 24 小时4.2.2 发酵培养基配制及培养 (1) 发酵培养基配制 按照材料与方法中的发酵培养基配方，计算出 10L 培养液所需各成分的含量并称取， 用自来水溶解后装入发酵罐，定容至 7.5L用高压蒸汽直接通入发酵罐灭菌，消后体积控 制在 9L灭菌条件：115℃,15 分钟 (2) 接种 将培养好的种子 10 瓶，在超净工作台上合并成 2 瓶，并用无菌棉塞塞好，待接种 火焰接种法从发酵罐的接种口倒入种子，盖上接种口盖子，撤去火圈，调节溶氧浓度 到 80%. 余下的一瓶种子做菌体干重。

3) 发酵过程控制 培养温度：30℃；搅拌转速：200 转/分钟；溶氧浓度 20%以上，当溶氧低于 20%时增 加转速，提高供氧，残糖浓度控制在 0.5％左右，低于 0.5%时流加 30%葡萄糖，流速根据 糖耗速率调整发酵过程 pH 用 10%NaOH 自动调节4.2.3 菌浓度测定 发酵前 8 个小时每隔 2 小时，以后每隔 4 小时从发酵罐取出 30ml 发酵液，取１ml 适 当稀释，用分光光度计在 600nm 波长下测定吸光值（A） ，要求 A 值在 0.2～0.6 之间，绘 制菌生长曲线，即菌体干重对时间的变化曲线4.2.4 糖消耗曲线 每隔 4 小时从发酵罐取出 30ml 发酵液，取其中 10ml，3000 转离心取 0.5ml 上清液 测残糖测定残糖用葡萄糖测定仪绘制糖消耗曲线，即糖浓度对时间的变化曲线4.2.5 NaOH 消耗曲线 每隔 4 小时记录一次 NaOH 消耗的毫升数，绘制 NaOH 消耗曲线4.2.6 提高溶氧的影响因素 当溶氧低于 20%时,分别采取提高转速或增加通气量来增加溶氧，比较两种调节方法的 效果五、实验安排五、实验安排 第一天第一天 a． 实验原理及要求讲解； b． 配制种子培养基、灭菌； c． 标定 pH 电极； d． 14:00 接种、摇床培养； 第二天第二天 a． 8:15 配制发酵培养基，进罐灭菌 b． 13:45 移种 c． 14:00 罐发酵培养 d． 取样，测定菌浓、残糖 e． 每小时按发酵批报项目记录各发酵参数 第三天第三天 a． 按发酵批报时间取样 b． 测定菌浓、残糖 c． 根据发酵情况进行补料 第四天第四天 a． 按发酵批报时间取样 b． 测定菌浓、残糖，根据发酵情况进行补料 c． 10:00 罐发酵结束，放罐 d． 13:30 数据整理与分析 第五天第五天 a． 撰写实验报告六、数据记录六、数据记录 见附件一“罐发酵批报”七、数据处理七、数据处理 （1）计算基质得率常数 YX/S （2）绘制酵母生长速率曲线、基质消耗速率曲线 （3）绘制酵母生长曲线、基质消耗曲线、NaOH 补加曲线 （4）比较糖消耗与菌体生长、NaOH 消耗的关系 （5）分析罐发酵曲线特点八、实验报告主要内容八、实验报告主要内容 （1）实验原理与目的 （2）每天实验内容和原始数据记录 （3）数据汇总 （4）数据计算与分析 （5）实验体会、小结与建议意见 实验报告格式见附件二“生物工程综合实验报告格式”九、思考题九、思考题 （1）实验中如何保证无菌条件？试从菌种制备、发酵罐操作等方面予以说明。

（2）发酵罐培养基灭菌，蒸汽从哪里进，哪里排？如何操作？ （3）为了达到要求的消后体积消前的培养基体积应如何确定？ （4）采取调节通气量或转速来提高溶氧，哪种方法效果显著？ （5）糖消耗与菌体生长、NaOH 消耗有什么相关性？ （6）在分批培养中菌生长速率有什么特点？ （7）菌体二次生长的特点是什么？在罐发酵曲线上如何反映？ （8）不测残糖，如何判断培养基营养已耗尽？试通过分析罐发酵曲线来说明。