生理试验方法概要.doc

试 验 方 法 王涛1.SOD（超氧化物歧化酶）：氮蓝四唑法（NBT）法称0.5g鲜样，加1ml磷酸缓冲液（0.05mol/L，PH＝7.8），冰浴研磨，研磨后再加1.5ml缓冲液，倒入离心管中，再用2.5ml缓冲液清洗研钵，倒入离心管中，平衡，低温（0～4℃）离心20min（10500rpm），离心后冷藏保存取型号相同的试管，试管中加50μL上清液(2支对照试管中各加磷酸缓冲液50μL)，分别加3ml反应液，其中1支对照试管置于暗处，其余各管于4000lx日光下反应20～30 min（要求各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）反应结束后，以不照光的对照管作空白，于560nm下比色测定吸光度值·磷酸缓冲液配制法：A：（0.2mol/LNa2HPO4溶液）：Na2HPO4·2H2O35.61g或Na2HPO4·7H2O53.65g或Na2HPO4·12H2O71.64g，蒸馏水定容至1000mlB：（0.2mol/L NaH2PO4溶液）：NaH2PO4·H2O 27.6g或NaH2PO4·2H2O31.21g，蒸馏水定容至1000ml0.1mol/L缓冲液配法A：x（ml）+B：y（ml）稀释至200ml；0.05mol/L稀释至400ml。

0.1 mol/Lx(ml)y(ml)PH0.05mol/Lx(ml)y(ml)PH12.387.76.061.039.07.084.016.07.591.58.57.891.58.57.894.75.38.0·反应液：水：磷缓：Met：NBT：EDTA-Na2：FD（核黄素）＝5：30：6：6：6：6150ml反应液组成：水12.7ml+磷缓76.3ml+Met15.25ml+NBT15.25ml+EDTA-Na215.25ml+FD15.25ml 130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：1.9399gMet用磷缓定容至100ml；750μmol/L氮蓝四唑溶液：0.06133gNBT用磷缓定容至100ml，避光保存；100μmol/L EDTA—Na2溶液：0.03721g EDTA—Na2用磷缓定容至1000ml；20μmol/L核黄素溶液：0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存·计算公式：以抑制NBT光化学还原50%所需酶量为酶活性单位(U)SOD总活性（units·g-1FW）＝(（Ack-AE）*V)/(0.5*Ack*W*Vt)SOD比活力(units·mg-1Pr)= SOD总活性/蛋白质含量Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（4ml），ml；Vt为测定时样品用量，ml；W为测定时样品重量（0.5g）；蛋白质含量单位为mg/gFW。

2.POD(过氧化物酶)：愈创木酚法取上清液20μL加入比色杯中（对照加20μL磷缓），加3ml反应液，马上读470nm下的OD值并计时，每隔1min读一次（读0、1、2、3min的OD值）·反应液：0.1mol/L，PH＝6.0的磷缓50ml，加入愈创木酚28μL，于磁力搅拌器上加热溶解，加入30％H2O219μL存于冰箱中·计算公式：POD总活性(△OD470·min-1·g-1FW)＝（△OD470*V）/(a*W*t)(V=4ml;a=0.02ml;W=0.5g；t＝1min) POD比活力（△OD470·min-1·g-1Pr）＝总活性/蛋白质浓度3.CAT（过氧化氢酶）：取上清液100μL加入比色杯中（对照加100μL磷缓），加3ml反应液，马上读240nm下的OD值并计时，每隔1min读一次（读0、1、2、3min的OD值）·反应液：0.1mol/L，PH＝7.0磷缓20ml，加0.1mol/L H2O25ml（5.68ml，30％H2O2定容至1000ml）·计算公式：CAT总活性(△OD240·min-1·g-1FW)＝（△OD240*V）/(a*W*t)(V=4ml;a=0.1ml;W=0.5g) CAT比活力（△OD240·min-1·g-1Pr）＝总活性/蛋白质浓度4.MDA（丙二醛）：取上清液1ml（对照加1ml水），加2ml0.67％TBA（硫代巴比妥酸），封口沸水浴15min，迅速冷却（用冷水冲泡），倒入指形管中，4000rpm下离心20min，取上清液于600nm、532nm、450nm下比色。

·0.67％TBA：称0.67gTBA，加少量1mol/LNaOH溶液，再用10％三氯乙酸定容至100ml·计算公式：C MDA（μmol/L）＝6.45（A532－A 600）－0.56A450（消除糖类物质的干扰作用）MDA (μmol/gFW)=C*V/W=0.1548(A532－A 600)－0.01344 A450(V=0.012L;W=0.5g)5.可溶性蛋白：考马斯亮兰G-250染色法取上清液20μL（对照加20μL水），加3ml考马斯亮兰，放置2min后，马上于595nm下比色G-250：100mg溶于50ml，90％的乙醇中，加入85％（w/v）磷酸100ml，定容至1000ml，常温下可放置一个月标准曲线：Ypro（μg）＝143.45OD+3.6（生）或＝143.56OD+1.28（园） 蛋白质含量（mg/gFW）＝（3*Y*V）/5*1000*a*W（Y标线值μg；V酶液总体积＝4ml；a＝0.02ml；W＝0.5g；3/5由于标线是5ml中的含量，而本试验为3ml；1000将μg变mg）6.ASP（抗坏血酸过氧化物酶）：抗坏血酸过氧化物酶（APX）：0.2ml酶提取液+2.8mlAPX反应液，290nm比色（10S/20S）。

E=2.8 mMcm-1）APX反应液：55 μl 30% H2O2（1mM）+0.02359g ASA（0.25mM）+0.01994gEDTA-Na2（0.1mM），磷酸缓冲液（pH7.0）定容至500ml取1.0g样品，加1ml提取液（磷酸缓冲液0.05mol/L，PH＝7.8；2mmol/LAsA；5mmol/LEDTA，现用现配），冰浴研磨，研磨后再加1ml提取液，倒入离心管中，再用2ml提取液清洗研钵，倒入离心管中，平衡，低温（0～4℃）离心20min（10000rpm）取上清液100μL加入比色杯中（对照加100μL提取液），加3ml反应液，马上读290nm下的OD值并计时，每隔1min读一次（读0、1、2、3min的OD值）·反应液：50mmol/L磷缓，PH＝7.0；0.1mmol/LEDTA；0.1mmol/L H2O2，0.5 mmol/LAsA·计算公式：ASP总活性(△OD290·min-1·g-1FW)＝（△OD290*V）/(a*W*t)(V=4ml;a=0.1ml;W=1.0g) ASP比活力（△OD290·min-1·g-1Pr）＝总活性/蛋白质浓度7．脯氨酸：0.5g鲜样（或0.05g干样），加5ml磺基水杨酸，封口沸水浴10min，冷却，用滤纸漏斗过滤，吸滤液2ml（对照吸蒸馏水2ml），加2ml冰乙酸，再加3ml酸性水合茚三酮显色液，沸水浴40min，冷却，加5ml甲苯，充分震荡，静置分层，取上层甲苯液于520nm下比色。

·3%磺基水杨酸：6g定容至200ml；·2.5%酸性茚三酮显色液：（150ml用量）3.75g茚三酮+90ml冰乙酸+24ml磷酸+36ml蒸馏水（4℃下2～3日有效）·标准曲线：Y脯氨酸=21.594OD-0.0785·计算公式：脯氨酸（μg/gFW或DW）=Y*V/a*W(Y由曲线查得；V提取液体积=5ml；a为测定时吸取的体积=2ml；W为样品重=0.5g)8.电导率：鲜样先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗2次，用打孔器打取圆片，取0.5g，装入大试管中，加入20ml蒸馏水，抽气3次，每次20min，第一次抽气后取出摇动，室温保持3～4h，多次摇动，测电导率S1，封口沸水浴10min，冷却（可用冷水冲泡），平衡10min后测S2，同时测定蒸馏水S0·计算公式：相对电导率（%）=100*（S1－S0）/（S2－S0）9.根系活力：根系去掉根尖和上部老根，取根0.4～0.5g，剪成2cm长的段，放入试管中，对照先加2ml，1mol/L的H2SO4，其余试管中加0.4%TTC和磷缓（1/15mol/L，PH＝7.0）等体积混合10ml，封口，放入37℃恒温箱中4h，取出，除对照外，其余加2ml，1mol/L的H2SO4终止反应，放置15min后，取出根，吸干，再放回原试管，各试管中加10ml，95%乙醇，封口，提取24h至根变白，根据颜色稀释3～5倍后，于485nm下比色。

·0.4%TTC：称TTC1g，溶于250ml水中·1/15mol/L，PH＝7.0的缓冲液：A61ml+B39ml，稀释至300ml·1mol/L的H2SO4：先在烧杯中加约100ml水，再加浓硫酸11ml，冷却后定容至200ml·计算公式：四氮唑还原强度（μg/gFW.h）=(OD+0.0035)/4*h*W*0.0022(h=4,W=0.4～0.5)10.叶绿素称取叶片0.2g，加20ml，80％的丙酮（80ml丙酮定容至100ml），封口，置于暗处24～36h，至叶片发白，于663nm、646nm、470nm下比色（以80％丙酮为对照）公式：色素浓度Ca（mg/L）＝12.21D663-2.81D646Cb＝20.13 D646-5.03 D663Cx.c＝（1000D470-3.27Ca-104Cb）/229色素含量（mg/gFW）＝C*V*n/W(V=0.02L,n=1,W=0.2g)11．硝酸还原酶（活体法测定）【样品应先照光2－3小时后采】称取叶片0.5g，剪成0.5-1.0cm2小块，加入试管中，对照先加1ml30％三氯乙酸溶液，然后再向各试管中加入0.1mol/l KNO3溶液9ml，抽气1小时，置于25℃暗反应30min。

然后向各试管中加入1ml30％三氯乙酸溶液【待叶片变色后（黄）】吸上清液1ml于新试管中，加2ml 1％的黄胺和2ml 0.02％萘胺溶液显色20min，540nm下比色吸光值不能大于2，否则应稀释再测）80个样的用量：0.1 mol/l，PH＝7.5的磷缓：A液420＋B液80＋水500，将KNO3 10.11 g溶于上述1000 ml磷缓中1％黄胺：称2.5克溶于62.5 ml浓HCL中，定容至250 ml0.02％N－1－萘乙二胺酸盐：称0.06克于300 ml水中30％三氯乙酸：称30克溶于100 ml水中标准曲线：Y NO2 =8.7317OD-0.4178计算公式：NR 活性（NaNO2 ug/gFW.h）=Y .n/W. h ( n=10/2,h=0.5)12.自由水/束缚水含量测定取称量瓶n（每处理6个，3次重复）个，编号，分别称准重量，用0.5cm2左右的打孔器打取300片，分别随机放入称量瓶中（各50片），盖紧，准确称取各瓶重量，求出各瓶样品鲜重，将其中3瓶置烘箱中于105℃下10min杀死组织，再于80℃下烘至恒重，求出组织含水量（%）将另外3个称量瓶各加入60%～65%（重量百分浓度）蔗糖溶液5ml，再准确称量求出各瓶糖液重量。