第八章类毒素教学文稿.ppt

第八章 类毒素 一、细菌毒素 (一)细菌毒素的概念 致病性细菌产生的毒性物质，统称为细菌毒素(bacterial toxoin)细菌毒素可分为内毒素(endotoxin)和外毒素(exotoxin)两类 内毒素一般指革兰氏阴性细菌细胞壁的外部结构而言，其化学成分是磷脂多糖蛋白质复合物这些成分在细菌生活时不分泌至体外，仅在菌体自溶或人工裂解后才释放出来内毒素性质稳定，耐热，毒性较外毒素弱内毒素不能经甲醛处理（脱毒）成为类毒素 内毒素 外毒素是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性细菌，少数革兰氏阴性细菌也能产生将这些细菌的液体培养物过滤除菌即可获得外毒素外毒素的毒性极强，如纯化肉毒梭菌外毒素1mg可杀死2000万只小鼠 各种细菌产生的外毒素对组织的毒性有高度的选择性，引起各自不同的特殊病变和临床症伏外毒素属蛋白质，一般容易被热、酸及消化酶灭活 外毒素可用甲醛脱毒，使之成为类毒素(toxoid)类毒素由于仍保持毒素的抗原性，能引起抗毒素的产生，故可用于人工免疫 外毒素(二)细菌外毒素的理化及生物学特性 细菌外毒素都是不联接辅基的单纯蛋白质，但组成不同外毒素各类氨基酸的含量具有一定差异，其抗原性也各不相同。

尽管如此，各种外毒素理化、生物学以及免疫学特性却有很多相同之处 1理化特性 外毒素分子在一定的pH及离子强度下能解离为小分子，在另一些条件下有些毒素可以由小分子单体聚合成大分于的二聚体或多聚体 Pillemer(1946)的研究表明：破伤风毒素沉降系数为4.6s，相当于分子量67kD，精制毒素沉降系数为7.0s，并认为这是毒素单体聚合相互封阻生物活性而形成的无毒的二聚体，白喉毒素也能以二聚体形式出现 3免疫学性质 外毒素是蛋白质，兼有毒性和抗原性，能刺激动物机体产生特异性抗体抗毒素，又能被这种特异性抗毒素结合而阻断其对把细胞的毒性作用 外毒素能够自然丧失毒性，也可人工使其丧失毒性，但丧失毒性的外毒素保留抗原性，被称为类毒素(toxoid) 二、类毒素 (一) 细菌产毒能力 并不是所有产毒性细菌菌株都具有相同的产毒力，为了获得更多的毒素，必须选择毒力强而且稳定的菌种 例如，白喉杆菌PW8株，就是19世纪末由Park及Williams最早分离的菌株之一，迄今仍为国际最常用的产毒株破伤风梭菌Harvard A47株、Haffkin株、罗马尼亚L-株和Toronto株等均为产毒力较强的菌株 1. 不同细菌产毒能力不同 保持产毒菌株产毒稳定性至关重要。

细菌变异能使产毒力丧失，经常连续传代不利于保持产毒的稳定性，应尽量避免冷冻或冻干保存产毒菌株，能够维持其比较性产毒菌株的产毒力一旦降低或丧失，可通过易感动物使其恢复 培养基的成分对细菌产毒有较大影响，应选择最适当培养基铁对于白喉毒素、锌对于魏氏梭菌毒素的产生都是重要的影响因素 此外，糖类、金属、维生素、氮源、pH等条件均应予以考虑 培养温度及时间对毒素的产生也有影响产毒最适温度一般要比生长最适温度低一些破伤风梭菌产毒受温度影响更大Miller观察，破伤风梭菌产毒最适温度为350.5C，低于33.6C或高于37C时，产毒量将比35C降低20-30% 2. 产毒细菌产毒能力的稳定性(二) 毒素的脱毒 自然或人为地使毒素变为类毒素的过程即脱毒(detoxification)，毒素脱毒应用最广泛、最可靠的方法目前仍是甲醛溶液法 1. 甲醛含量 甲醛浓度越高，脱毒越快，但抗原性损失大如有人证明，用0.5%福尔马林脱毒之类毒素，其结合力仅相当于0.2%福尔马林脱毒类毒索结合力的2/32. 温度 温度越高，脱毒越快，超过40C 对抗原性有很大破坏，一般脱毒采用37-39C；3. pH 在微酸性时脱毒速度慢，抗原性保持较好，在碱性时脱毒速度快，但类毒素抗原件易受破坏；脱毒的影响因素主要有以下各点：(三)类毒素的精制 用人工培养法所制得的粗制类毒素液含有大量的非特异杂质，而毒素含量则较低。

因此，有必要对类毒素进行浓缩精制浓缩精制的方法很多，可根据不同的目的和不同条件，进行适当选择 1物理学方法 物理学方法包括用冷冻干燥、蒸发、冻融等方法除水浓缩；也包括用氧化铝和磷酸钙胶等固相吸附剂吸附 2化学沉淀法 化学沉淀法包括酸沉淀法，常用的有盐酸、硫酸、磷酸、三氯醋酸等盐析法，常用的中性盐有硫酸铰、硫酸钠及磷酸盐缓冲液等；有机溶剂沉淀法，如甲醇、乙醇及丙酮等重金属阳离子沉淀法，包括Mg2+、Ca2+、Zn2+等，其中以氯化锌应用最广 3层析法 层析法包括凝胶过滤和离子交换层析 (五)破伤风明矾沉降类毒素制造 破伤风毒素为蛋白质，含氮15.7%，硫1.0%，不含碳水化合物和类脂，等电点为5.0-5.2毒素产量相当于细菌重量的5%-10% 根据规程规定，制造破伤风类毒素应选择毒素产量高、免疫原性强的菌种产毒菌培养5天，产毒力每毫升致死试验量应在400万以上，最小致死量应在200万以上培养基应选用产毒培养基，如8%甘油冰醋酸肉汤、牛肉胨水消化液或黄豆蛋白胃酶水解液培养基 (1) 种子繁殖 将检定合格的菌种移植于碎肉肉汤管中，于37C培养48h，连续移植两次，纯检合格后，作为制造毒素用的生产种子。

1制造及检验 培养基高压灭菌后，急速冷却至45-50C，按0.2%-0.3%接种量种子菌液，34-35C培养5-7天，由每瓶抽样品作革兰氏染色镜检和纯粹检验，同时每批取5瓶样品等量混合，滤除菌体测定毒素，测定方法如下： (2)毒素制造 B. 致死试验量(LD)的测定: 毒素用生理盐水作300倍、400倍等稀释，每1ml不同稀释度的毒素中，加入0.1国际单位（IU）的标准抗毒素1ml，再加生理盐水2m1，37C 45min，每一稀释度各皮下注射体重15-17g小白鼠2只，剂量为0.4ml注射后72-120h内，小白鼠应发生破伤风症状，2只全部死亡的毒素最大稀释度，即为每1ml所含的致死试验量 A. 最小致死量（MLD）的测定: 毒素用1%蛋白胨水作40万倍、50万倍、60万倍稀释，每一滴度的毒素，用体重15-17g小白鼠2只，各皮下注射0.2m1小白鼠发生破伤风症状，96h内2只小鼠死亡毒素最大稀释度的5倍，即为每1ml所含的小白鼠最小致死量 毒素培养5-7天完成，抽取样品作纯粹检验和毒素测定的同时，立即加入0.4%的甲醛，充分振荡均匀，置37-38C温室中脱毒21-31天，取出静置7-10日后，抽取上清液用纱布滤过，随即按类毒素量加入0.01%硫柳汞，摇匀后用灭菌蔡氏滤器滤除菌体和沉淀物。

(3)类毒素制造 按总量的2%精制明矾所需量，用蒸馏水配置10%明矾液，与定量的类毒素均匀混合，定量分装 A.无菌检验 从每瓶抽取适量类毒素，分别接种普通琼脂斜面、厌气肉肝汤各2管和50ml肉汤三角瓶1瓶，置37C培养5-7日，均应无菌生长 (4) 类毒素的检验B.安全试验 用体重30O-380g豚鼠2只，各后肢一侧皮下注射2%明矾沉降类毒素1m1，对侧注射4m1，观察21天在注射1ml的一侧，允许局部有小硬结，而在注射4ml的一侧只允许有小溃疡，无破伤风症状发生，在21日痊愈安全检验的豚鼠应全部存活C.效力检验 用体重300-380g豚鼠3只，每只皮下注射破伤风明矾沉降类毒素0.2m1，15-30天后，各皮下注射破伤风标准毒素稀释液300个以上的豚鼠MLD另外用300-380g未经免疫的健康豚鼠之只作为对照，各皮下注射破伤风标准毒素1个豚鼠的MLD对照豚鼠应发生破伤风于4-6天全部死亡，免疫豚鼠应无任何破伤风症状，观察10日全部健活 2.应用 (1) 保存期 类毒素保存于1-15C，从加甲醛之日起，有效期为3年2) 用法与用量 大动物皮下注射1m1小驹幼畜减半，经6个月后再注射1次。

绵羊及山羊皮下注射0.5ml3) 免疫期 注射后1个月产生免疫力，持续时间为1年，第二年再注射1m1，免疫力可持续4年。