实验六_脂糖凝胶电泳鉴定DNA.doc

实验六脂糖凝胶电泳鉴定DNA%1. 原理用于DNA分离、纯化和鉴定的凝胶电泳有二类，一类是琼脂糖凝胶电泳，适用于Ikb和 大于Ikb以上DNA；另一类是聚丙烯酰胺凝胶电泳，适用小于Ikb的DNAo琼脂糖凝胶电泳是 —种非常简便，快速分离、纯化和鉴定DNA的方法，已广泛应用于核酸研究中DNA在琼脂 糖凝胶中迁移率和凝胶浓度、DNA分子大小、DNA分子的构象及电泳电压密切相关染色采用 澳化乙锭(EB), EB在紫外线照射下的发射荧光EB能插入DNA分子中形成荧光结合物，使发 射的荧光增强儿十倍荧光的强度正比于DNA的含量.如将已知浓度的标准样品作电泳对照, 就可估计出待测样品的浓度1. 方法1. 制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖0. 105g,溶解在15ml电泳缓冲液中，置微波炉中至琼 脂糖溶化均匀2. 灌胶：将电泳槽载胶板两侧用透明胶布或医用胶布密封好.防止.灌胶时出现渗漏然 后在凝胶溶液中加EB 3plo摇匀插好点样梳子，轻轻倒人电泳槽载胶板中除掉气泡3. 待凝胶冷却凝固后，轻轻取出点样梳，将电泳槽载胶板两侧封胶用的透明胶布或医 用胶布撕下4. 点样：提取的质粒DNA样品液叫8pl+1.6pl浪酚蓝指示剂，混匀、点样。

记录点样次序及点样量o5. 在电泳槽中加入电泳缓冲液，将点好样的载胶板轻轻放在电泳槽内6. 电泳：接上电极线，点样侧接电泳仪负极，蝇一侧接电泳仪正极，50V电泳45至60 分钟7. 将电泳槽载胶板拿到暗室，在紫外灯下直接观察结果%1. 试剂：1. 电泳缓冲液：40mmol / L Tris—HCL(pH8. 0)20mmol / L NaAC2mmol / L EDTA配制方法：先配50倍电泳缓冲液，用时取5成，重蒸水稀释至250mlo50倍电泳缓冲配制方法：Tris 12. lg无水 NaAC 41.0gEDTA . Na2 18.6g先用400ml重蒸水加热搅拌溶解后,再用冰乙酸调节pH至8.0 (大约25毫升)，然后加蒸水 定容至500mlo 1. 1kg / cm2灭菌20分钟2. 漠酚瓶指示剂：称取酚蓝200mg.加重蒸水10ml.在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖50g,加蒸馅水 溶解后移入溟酚蓝溶液中，摇匀后加重蒸水定容至100ml.加lOmol / LNaOH 1〜2滴，调至 蓝色3. EB： (10 mg/ml 漠化乙锭)配制方法：漠化乙锭 1 gdd&O 100 ml4. 琼脂糖%1. 仪器微波炉电泳仪手提式紫外检测仪电泳槽%1. 说明1. DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率与凝胶浓度、DNA分了大小、DNA分子构象及电 泳电压有关。

1) 凝胶浓度 根据待分离DNA分子的大小，选择凝胶中琼脂糖的含量(凝胶浓度)琼脂糖的含量偶)分离线状DNA分子I妁有效范围(kb)0. 360 — 50.620— 10.710—0. 80.97 — 0. 51.26—0. 11.54 — 0. 12.03—0. 1(2) DNA分子大小 线状双链DNA分子在一定浓度凝胶上电泳的迁移率与线性双链DNA分 子的分子量对数成反比3) DNA分子的构象 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中电泳动距离与DNA的分 子量对数成反比，但当DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动的距离不仅和分子量有关, 还和它本身构象有关有相同分子量的线状、开环状(超螺旋为0)和超螺旋DNA在琼脂糖凝 胶中移动速度是不一•样的高度超螺旋的DNA枪动速度最快，随着超螺旋程度降低.相应DW 的移动速度依次也慢，最慢者为线状双链D\A例如SV40病毒DNA处于高度超螺旋状态，电 泳速度最快，经拓扑异构酶作用产生不同程度的超螺旋DNA在凝胶电泳时，按不同速度在胶 上移动而形成多条带了解这-点对分析DNA电泳图谱至关重要当用琼脂糖凝胶电泳鉴定 质粒纯度时，发现凝胶上有数条DNA带，难以确认是由于质粒本身存在看超螺旋引起的，还 是因为含有其他DNA引起的可采用上述方法鉴定。

从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个问收，用同 —•种限制性内切酶切，然后在琼脂糖凝胶上电泳，如果在凝胶上出现相同的DNA图谱，贝U说 明它们是处于不同超螺旋状态的同一种DNA4) 电源电压 低压条件下，线状DXA在琼脂糖凝胶上泳动迎度和电压成正比随着电压 升高，高分子量的DNA片段泳动速度和电压不成正比关系，分辩率下降了，因此为了得到良 好的分离效果，电场电压不要超过5V /CM2. DNA琼脂糖凝胶电泳图谱分析离不开紫外分析灯，可是紫外光对DNA分子有切割作用 从胶上同收DNA供重组用时，避免紫外光切割是非常重要的，尽量缩短光照时间并采用长波 长紫外灯(300~360nm)可减少紫外光切割DNA3. 溟化乙锭(EB)染色：演化乙锭是核酸的染色剂，在水平式琼脂凝胶电泳中DNA的染色, —,般有三种做法：(1) 在制胶中与电泳缓冲液中同时加入0. 5pg/ml的EBo(2) 只在胶中加入0. 51pg/ml的EB,而在电泳缓冲液中不加EB,这就减少了操作时双 手受EB污染的机会，而且DNA区带也清晰可见这是目前绝大多数实验使用的方法3) 在电泳结束以后，取出琼脂糖产凝胶，放在含有0. 5pg / ml EB的电泳缓冲液(或 ddH’O)中染色40分钟。

如果天气寒冷.琼脂糖浓度高凝胶板厚也可在37E保温染色或轻微 振荡染色也可采用加大EB的剂量(Ipg / ml)或延长染色时间比较3种使用EB方法，采用(1)与⑵可与实验过程中随时观察DNA的迁移情况，极为 方便但是(1)的操作更需小心，谨慎，防止实验用具及台面的EB污染所以一•般选用⑵ (2)的好处是电泳过程中DNA保持本来的状态，有利于凝胶图漕分析，更能准确地测定DNA 分子量因为在凝胶中有EB时，-•定量EB插入DNA就会使双链线状DNA的迁移速度卜•降EB是强致癌剂因此使用过程上要注意戴手套，及时用高镒酸钾处理污染物具体的方 法如下1) 加入足量的水使漠化乙锭的浓度降低至0. 5pg / ml以下2) 加入1倍体积的0. 5mol/ L KMnOo小心混匀后再加1倍体积的2. 5mol /L HCL混 匀，于室温放置数小时3) 加入1倍体积的2. 5mol/L NaOH,小心混匀后可丢弃该溶液以前曾广泛采用的用次氯酸处理漠化乙锭稀溶液的方法，效果不好此外，溟化乙锭在262C分解，在标准条件下焚化后也不再具有危害性4. Y臭酚蓝指示剂：常用的电泳上样缓冲液含漠酚蓝，有的还含有二甲苯青.这些指示剂 可以指示电泳的速度，也可以利用其迁移率大致估计DNA的分子量。

澳酚蓝在琼脂糖凝胶中 移动的速率约为二甲苯青FF的2. 2倍，而与琼脂糖浓度无关以0. 5 X TBE作电泳缓冲液 时，漠酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动 则与长4kb的双链线状DNA相同在琼脂糖浓度为0. 5〜1. 1%的范围内，这些对应关系受凝 胶浓度变化的影响并不显著，但在聚丙烯酰胺凝胶中其对应关系受凝胶浓度影响较大(详见附 录表三)此外蔗糖使样品密度增大，使样品在点样时沉于点样孔底部，不扩散上样缓冲液 —•般配成6倍的，如样时，加入点样量的1/6即可。