实验13地衣酚法测定rna含量.docx

实验13地衣酚法测定RNA含量-华南师范大学生命科学学院新…（总2页）--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--实验13地衣酚法测定RNA含量一、目的学习和掌握测定RNA含量的定糖法（地衣酚法）的原理和操作技术二、原理核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糖醛，后 者与3, 5—二羟基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化 铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收，RNA浓度在20~200微克/毫 升范围内，光密度与RNA的浓度成正比关系，在反应液中如混有DNA或其他 杂质也能给出类似的颜色因此测定RNA时可先测定DNA的含量，再计算 RNA的含量HC—CHH G 告—YH —CHH O —— C ~ s, G—O H OI 〃CH—Ch inH C —CH 0 牧无机酸 口£夕尸夕 s——一 ‘ 言—H G C — U0 密无机酸II 垛色化合物\ △OH地衣酚法只能测定RNA中与嘌吟连接的核糖，不同来源的RNA所含嘌吟 与嘧啶的比例各不相同，因此，用所测得的核糖量来换算各种RNA的含量存在 误差最好用被测样品相同来源的纯化RNA作RNA核糖标准曲线，然后从曲 线求得被测样品的RNA含量。

三、材料、试剂和器具（一） 试剂1、 RNA标准溶液：取酵母RNA配成200微克/毫升的标准溶液（如不溶， 可滴加氢氧化铵溶液，调至pH 二）2、 样品溶液：RNA浓度在20~100微克/毫升范围内自己提取）3、 地衣酚试剂，先配制%三氯化铁浓盐酸溶液（A、R）使用前再用上述 溶液为溶剂配成%的地衣酚溶液临用时配制）（二） 器具1、 试管及管架2、 水浴锅3、 移液管（1，2，5ml）4、 可见光分光光度计四、操作步骤（一）RNA标准曲线的制作取8支试管，编号，按下表加入试剂加毕，摇匀，置沸水浴中加热15分钟，冷却，测值以值为纵坐标，RNA含量（微克/毫升）为横坐标作图绘制标准曲线二）样品的测定取~毫升样品液于试管中，加蒸馏水稀释至2毫升，后加2毫升地衣酚试剂 摇匀，于沸水中煮15分钟，冷却，测根据测得的光密度值，从标准曲线上查 出相当该光密度的RNA的含量，按下式计算样品中RNA的百分含量RNA含量/毫升待测液二标准曲线查得值x稀释倍数含量/毫升x总体积RNA产率（%）= 新鲜肝重（g）x xioo106五、 注意事项样品中蛋白质含量较高时，应先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白质后再测定六、 实验报告附上绘制标准曲线图，并计算RNA的含量及产率。

七、 思考题1、 采用该法测定RNA的含量有何优点及缺点2、 地衣酚反应中，干扰RNA测定的因素有哪些如何能减少它们的影响。