第九章色谱法概论2.ppt

第九章第九章 色谱法概论色谱法概论重点n1.色谱法分类：按流动相分类、按分离原理分类、按操作形式分类、按分离目的分类n2.色谱图及常用术语：半峰宽、基线宽度、保留时间、保留体积、拖尾因子、相对保留值、分配系数、容量因子、保留因子n色谱分析法简称色谱法或层析法（chromatography)，是一种物理或物理化学分离分析方法n原理：利用物质在流动相与固定相之间的分配系数差异而实现分离n色谱法与光谱法的区别：          色谱法具有分离及分析两种功能，而光谱法不具备分离功能；色谱法是先将混合物中各组分分离，而后逐个分析，是分析混合物最有力的手段一、色谱法的由来一、色谱法的由来        1．1906年由俄国植物学家Tsweet创立色谱法 分离植物色素时采用 他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带这种方法因此得名为色谱法以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今植物色素分离见图示   图示Ø固定相固定相——CaCO3颗粒颗粒Ø流动相流动相——石油醚石油醚 色带色带色带色带在色谱分析中有流动相和固定相两种. 流动相指色谱过程中携带组分向前移动的物质. 固定相是色谱过程中不移动的具有吸附活性的固体或涂在载体表面上的液体.        装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱色谱柱  。

概述当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出色谱法色谱法 与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测组分的分离与检测¨ 两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础2．现在：一种重要的分离、分析技术                    分离混合物各组分并加以分析        固定相——除了固体，还可以是液体     流动相——液体或气体    色谱柱——各种材质和尺寸    被分离组分——不再仅局限于有色物质              三  色谱法的分类n按流动相与固定相的分子聚集状态分类：    气相色谱法（GC）、液相色谱法（LC）和超临界流体色谱法（SFC）续前2．按固定相的固定方式分：．按固定相的固定方式分：3．按分离机制分：．按分离机制分：平面色谱平面色谱平面色谱平面色谱 纸色谱纸色谱 薄层色谱薄层色谱 高分子薄膜色谱高分子薄膜色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱 填充柱色谱填充柱色谱 毛细管柱色谱毛细管柱色谱 分配色谱分配色谱分配色谱分配色谱：利用分配系数的不同：利用分配系数的不同 吸附色谱吸附色谱吸附色谱吸附色谱：利用物理吸附性能的差异：利用物理吸附性能的差异 离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱：利用离子交换原理：利用离子交换原理 空间排阻色谱空间排阻色谱空间排阻色谱空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同：利用排阻作用力的不同（1）吸附色谱法 n以吸附剂作为固定相，有机溶剂作为流动相，利用样品中不同组分在吸附剂上吸附能力的差别，而进行分离分析的一种色谱方法。

（2）分配色谱法 n以液态的溶剂（通常把这种溶剂又叫固定液均匀地涂布在载体的表面）作为固定相，与之不相混溶的另一溶剂作为流动相，利用样品中不同组分在这互不相溶的两相中溶解度（分配系数）的差异，而进行分离分析的一种色谱方法 （3）键合相色谱法 n将有机分子（固定液）通过适当的化学反应以共价键的形式结合在载体（支持剂）的表面，所制备的固定相称为化学键合固定相使用化学键合固定相的色谱方法称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱法 （4）空间排阻色谱法 n 以凝胶（有机高分子的多孔聚合物）作为固定相，有机溶剂或水溶液作为流动相，利用样品中不同组分的分子尺寸的差异进行分离分析的一种色谱方法，称为空间排阻色谱法或凝胶色谱法（5）离子交换色谱法 n以离子交换剂作为固定相，水溶液作为流动相，利用样品中不同组分（离子性化合物）的交换能力的差别而进行分离分析的一种色谱法称为离子交换色谱法 四、色谱法的特点四、色谱法的特点ü优优点点：：“三三高高”、、“一一快快”、、“一广一广”ü缺点：缺点： 高选择性高选择性高选择性高选择性————可将性质相似的组分分开可将性质相似的组分分开可将性质相似的组分分开可将性质相似的组分分开 高效能高效能高效能高效能————反复多次利用组分性质的差异反复多次利用组分性质的差异反复多次利用组分性质的差异反复多次利用组分性质的差异 产生很好分离效果产生很好分离效果产生很好分离效果产生很好分离效果 高灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度——10——10-11-11~10~10-13-13g g，，，，适于痕量分析适于痕量分析适于痕量分析适于痕量分析 分析速度快分析速度快分析速度快分析速度快————几几几几~ ~几十分钟完成分离几十分钟完成分离几十分钟完成分离几十分钟完成分离 一次一次一次一次 可以测多种样品可以测多种样品可以测多种样品可以测多种样品 应用范围广应用范围广应用范围广应用范围广————气体，液体、固体物质气体，液体、固体物质气体，液体、固体物质气体，液体、固体物质 化学衍生化再色谱分离、分析化学衍生化再色谱分离、分析化学衍生化再色谱分离、分析化学衍生化再色谱分离、分析 对未知物分析的定性专属性差对未知物分析的定性专属性差 需要与其他分析方法联用需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS)(GC-MS,LC-MS)第2节  色谱过程与术语n一、 色谱过程：n色谱过程是当流动相中携带的混合物流当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。

经固定相时，其与固定相发生相互作用由于混合物中各组分在性质和结构上的差由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出定次序由固定相中流出ü以吸附色谱为例见图示                         吸附→ 解吸→再吸附 →再解吸 →反复多次洗脱→被测组分分配系数不同→ 差速迁移 → 分离图示n分配系数的微小差异→吸附能力的微小差异n微小差异积累→较大差异→吸附能力弱的组分先流出；                                                    吸附能力强的组分后流出back色谱过程示意图二、色谱流出曲线和基本概念二、色谱流出曲线和基本概念1．流出曲线和色谱峰2．保留值：色谱定性参数3．色谱峰的区域宽度：色谱柱效参数 1．流出曲线和色谱峰．流出曲线和色谱峰流出曲线流出曲线（色谱图）（色谱图）：电信号强度随时间变化曲线色谱峰色谱峰：流出曲线上突起部分从色谱图上可以得到许多重要信息：n①根据色谱峰的个数，可以判断试样中所含组分的最少个数。

n②根据色谱峰间的距离，可评价色谱条件的选择是否合理n③利用色谱峰的保留值及区域宽度，可评价柱效n④根据色谱峰的保留值，可以对组分进行定性分析n⑤根据色谱峰的面积或峰高，可以对组分进行定量分析 基本概念 （1）如果进样量很小，浓度很低，则色谱峰是对称的 基本概念 mV0Ø正常峰与不正常峰前延峰正常峰拖尾峰t正常峰（对称正常峰（对称正常峰（对称正常峰（对称））））非正常峰非正常峰非正常峰非正常峰 前沿峰前沿峰前沿峰前沿峰 拖尾峰拖尾峰拖尾峰拖尾峰色谱峰色谱峰色谱峰色谱峰正常峰的判断n对称因子fS（symmetry faxtor）或叫拖尾因子n对称因子在0.95～1.05之间为对称峰；小于0.95为前延峰；大于1.05为拖尾峰 基本概念（2） n2.    基线：在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线称为基线其反映的是仪器（主要是检测器）的噪音随时间的变化三）峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示第二节  色谱流出曲线及有关术语                                         色谱流出曲线n色谱流出曲线和色谱峰n基线（a）n峰高（h）信号进样空气峰色谱峰ha3．色谱峰区域宽度 色谱峰宽有三种表示方法：n1）标准偏差 n即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半 n2）半峰宽 n即峰高一半处对应的宽度 基线宽度W n通过色谱峰两侧拐点处的切线在基线上截距间的距离，即0.134倍峰高处色谱峰的宽度 n色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。

 n（1）死时间（tm）：分配系数为零的组分的保留时间称为死时间不被固定相溶解或吸附的组分的保留时 间（即组分在流动相中的所消耗的时间），或流动相充满柱内空隙体积占据的空间所需要的时间，又称流动相保留时间（dead time） nw4.    保留值（滞留值）：是色谱的定性参数保留值（滞留值）：是色谱的定性参数（2）保留时间（tR）n：从进样开始到某个组分的色谱峰顶点的时间间隔成为该组分的保留时间（retention time）n由于组分在色谱柱中的保留时间tr包含了组分随流动相通过柱子所须的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tr实际上是组分在固定相中保留的总时间n保留时间是色谱法定性的基本依据n（3）调整保留时间（t‘R）：某组分由于溶解（或被吸附）于固定相，比不溶解（或不被吸附）的组分在柱中多停留的时 间 称 为 调 整 保 留 时 间 （ adjuxted time）nt'R = tR－tm续前4）保留体积）保留体积VR：从进样开始到组分出现浓度极大点时所消耗的流动相的体积 5））死体积死体积Vm：不被保留的组分通过色谱柱所消耗的流动相的体积，又指色谱柱中未被固定相所占据的空隙体积，即色谱柱的流动相体积（包括色谱仪中的管路、连接头的空间、以及进样器和检测器的空间）续前6）调整保留体积）调整保留体积VR’：保留体积与死体积之差，即组分停留在固定相时所消耗流动相的体积７．相对保留值 n待测成分i与基准物质S的调整保留值之比，称为待测成分i对基准物S的相对保留值n相对保留值也可以是它们的分配系数、容量因子之比 n    只与柱温、固定相和流动相的性质有关。

而与柱径、柱长、填充均匀程度和流动相流速无关，因此是色谱定性分析的重要参数之一亦可用于衡量色谱的选择性某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为选择性因子  由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据8））选择性因子 α：调整保留值之比 9.分离度 分离度定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值 R = 2 (tr2 - tr1) / W1 +W2 R值越大，表明相邻两组分分离越好一般说，当R<1时，两峰有部分重叠；当R=1时，分离程度可达98%；当R=1.5时，分离程度可达99.7%通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志分配系数分配系数K 分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次的分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次的吸附-脱附过程这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数K10 分配系数n分配系数”的定义：在一定压力和温度下，达到分配“平衡”后，组分在固定相（s）与流动相（m）中的浓度（C）之比为分配系数（K）。

分配系数仅与组分、固定相和流动相的性质及温度有关注：注：注：注：K K为热力学常数为热力学常数 与组分性质、固定相性质、流动相性质及温度有关与组分性质、固定相性质、流动相性质及温度有关 实验条件固定，实验条件固定，K K仅与组分性质有关仅与组分性质有关分配系数分配系数 K的讨论的讨论ª 一定温度下，组分的分配系数一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；越大，出峰越慢；ª某组分的某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出时，即不被固定相保留，最先流出11．．容量因子容量因子 容容量量因因子子（容量比，分配比）k：指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配平衡时，在固定相与流动相中的质量比——更易测定分配系数分配系数K ：12.保留因子 R’ ：：nR’：表示溶质分子在流经整个柱时的相对移动速度 n同理，溶质分子在色谱柱中经过同样路程的保留体积VR将是流动相体积VM的l/倍 在色谱柱（或薄层板）一定时，Vs与Vm一定；若流速、温度一定，则t0一定这样，tR取决与分配系数K，K大的组分tR长K与组分、流动相和固定相的性质及温度有关因此，在实验条件一定时， tR取决于组分的性质，因而， tR可用于定性讨论：讨论： K↑K↑，，t tR R↑ ↑ ，，组分后出柱组分后出柱 K=0K=0，，组分不保留组分不保留 K→∞ K→∞ ，，组分完全保留组分完全保留14、色谱分离的前提n设二组分A，B的混合物通过色谱柱，若被分离，则说明其在色谱柱中的保留时间不等，有：n所以，若保留时间不等，则分配系数不等。

n分配系数不等或容量因子不等是色谱分离的前提条件Ø 结论：结论：色谱分离前提色谱分离前提→各组各组分分配系数不等分分配系数不等ü 注：应选择合适分离条件使得难分离的组分K不等例：n在一个3.0m的色谱柱上，分离一个样品的结果如下图： 计算：(1)两组分的调整保留时间 ；(2)两组分的容量因子；(3)两组分的分配系数之比    (4) 两组分的保留因子 单选题n1. 以下(      )不属于描述色谱峰宽的术语    nA 标准偏差            B 半峰宽              C 峰宽           D 容量因子n2. 在色谱流出曲线上，相邻两峰间距离决定于(      )nA 两组分分配系数       B 扩散速度          C 理论塔板数       D 塔板高度n3. 色谱法中以下何保留值和流动相流速相关(      )nA 保留体积           B 调整保留体积           C 保留时间       D 保留指数n4. 某色谱峰，其峰高0.607倍处色谱峰宽度为4mm，半峰宽为(      )nA 4.71mm             B 6.66mm           C 9.42mm         D 3.33mmn5. 容量因子为10时，溶质在流动相中的百分率为(      )。

nA 9.1%               B 10%              C 90%           D 91%(2)判断题 n1．色谱峰宽的三种表示方法分别为标准偏差、半峰宽及峰高 (     )n2．分配色谱法的固定相为液体，利用样品组分在固定相与流动相中的溶解度不同，所造成的分配系数差别而分离     )n3．容量因子是在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相中平衡浓度的比值      )n4．若两组分K值不同，则K值小的组分在流动相中浓度小，后流出色谱柱      )n5．分配系数是每一个组分的特征值,它不仅与两相性质和温度有关，还与两相体积、柱管特性有关      )n6. 分配比，表示在一定温度和压力下，两相平衡时，组分在两相中的质量比      )计算n1. 某色谱柱固定相体积为0.5mL,流动相体积为2mL流动相的流速为0.6mL/min，组分A和B在该柱上的分配系数分别为12和18，求A、B的保留时间和保留体积(提示：流动相的体积及为死体积Vm)                                                      (13.33min、18.33min、8mL、11mL)。