辣椒疫病生防菌的筛选、鉴定及其抑菌机理初探.docx

辣椒疫病生防菌的筛选、鉴定及其抑菌机理初探 摘要：采用平板稀释法和平板对峙试验，从武汉、荆州、宜昌和荆门等地的辣椒根际土壤中别离到１８５株细菌，筛选到１株具有高效拮抗辣椒疫霉菌、马铃薯葡萄糖培养基〔ＰＤＡ〕１．２土样采集和处理从武汉、荆州、宜昌和荆门等辣椒种植区疫病发生严重的田地，利用五点采样法从生长健康辣椒根际采集土样采样时铲去表层５ｃｍ土层，取新鲜土样５００ｇ，用保鲜袋保存称取土样１０ｇ参加装有９０ｍＬ无菌水的三角瓶中〔内装玻璃珠假设干〕，３０℃、１２０ｒ／ｍｉｎ振荡３０ｍｉｎ，静置后获得土壤悬液１．３生防细菌的筛选将土壤悬液稀释成１０－５、１０－６、１０－７浓度，吸取不同稀释度的土壤悬液１００μＬ涂布于ＮＡ培养基上，置于２８℃培养４８ｈ，挑取颜色、形态等不同的细菌单菌落并纯化、保存采用平板对峙法测定别离到的细菌对辣椒疫霉的抑菌活性将辣椒疫霉菌在ＰＤＡ平板上活化，用打孔器在菌落边缘打取菌块〔直径６ｍｍ〕，接种到ＰＤＡ平板中央培养１ｄ后，在距离辣椒疫霉菌块２ｃｍ处的４个对接点接种待测细菌，２８℃培养，５ｄ后观察抑菌结果，每个处理设３次重复１．４拮抗菌株的鉴定将筛选到的抑菌效果较好的菌株进行菌落形态观察、显微形态观察、革兰氏染色、芽孢染色、水解淀粉试验、甲基红试验〔Ｍ．Ｒ〕、Ｖ．Ｐ试验、柠檬酸盐试验、接触酶反应试验、明胶液化试验、运动性试验等主要形态和生理生化指标鉴定［５，６］。

参照文献［７］方法提取疑似枯草芽孢杆菌基因组ＤＮＡ根据已报道的枯草芽孢杆菌１６ＳｒＤＮＡ的保守区序列设计引物ＢｓＦ〔５′－ＴＧＣＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴ－３′〕和ＢｓＲ〔５′－ＧＧＧＴＴＧＣＣＣＣＡＴＴＣＧ－３′〕，以枯草芽孢杆菌疑似株基因组为模板，进行ＰＣＲ扩增ＰＣＲ反应程序为：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，５４℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，共３０个循环；最后７２℃延伸１０ｍｉｎＰＣＲ产物经试剂盒纯化后测序，将测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ数据库中的序列进行比照分析，利用ＭＥＧＡ４．１软件构建进化树１．５拮抗菌株的抑菌谱试验拮抗菌对各试验病原真菌的拮抗作用均采用平板对峙法，各试验重复３次２８℃下培养５ｄ后，测量抑菌带的宽度和菌落半径，计算拮抗菌对病原真菌生长的抑制率对病菌生长的抑制率＝〔对照菌落半径－处理菌落半径〕／对照菌落半径１００％１．６拮抗菌株对辣椒疫病菌菌丝形态的影响将辣椒疫病菌在ＰＤＡ培养基上接种培养３ｄ后，用打孔器打取直径５ｍｍ的菌块置于盛有２０ｍＬＰＤA培养基的无菌培养皿中，２８℃培养２ｄ将培养好的辣椒疫病菌菌块分别用拮抗菌株的无菌培养滤液和菌体悬浮液处理２４ｈ后，以无菌水处理为对照，挑取菌丝在倒置显微镜下观察其形态，每处理重复３次。

２结果与分析２．１拮抗细菌的筛选结果从健康辣椒根际土壤中共别离到１８５株细菌，从中挑取菌落形态、颜色与枯草芽孢杆菌〔Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ〕相似的细菌４８株采用平板对峙法测定上述４８株细菌的抑菌活性，结果说明有２９株能够抑制辣椒疫霉的生长，但抑菌程度不同其中抑菌圈直径为７．０～８．０ｍｍ的有１株，为５．０～７．０ｍｍ的有６株，为３．０～５．０ｍｍ的有２２株编号为Ｂｓ０４的菌株抑菌效果最强〔图１〕２．２拮抗菌株Ｂｓ０４的鉴定结果２．２．１形态学和生理生化指标菌株Ｂｓ０４在ＮＡ平板上培养２ｄ后，菌落圆形或椭圆形，乳白色，中央凹陷，外表枯燥，有褶皱，不透明菌体为杆状，大小为〔０．７~０．８〕μｍ〔２．０~３．０〕μｍ，革兰氏染色阳性，其他生理生化指标鉴定结果见表１２．２１６ＳｒＤＮＡ序列与同源性分析以拮抗菌株Ｂｓ０４的基因组ＤＮＡ为模板，用ＢｓＦ和ＢｓＲ为引物，进行ＰＣＲ扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测到１条大小约１５００ｂｐ的清晰条带〔图２〕，测序结果为１５３８ｂｐ将测序结果在ＮＣＢＩＧｅｎBａｎｋ上进行序列比对〔比对号ｌｃｌ２８０１７〕，发现其与枯草芽孢杆菌１６ＳｒＤＮＡ序列的相似性高达９９％，初步确定拮抗菌株Ｂｓ０４为枯草芽孢杆菌〔Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ〕。

将菌株Ｂｓ０４的１６ＳｒＤＮＡ序列上传ＧｅｎBａｎｋ，获得基因序列号ＫＦ７２５６３６，并利用ＭＥＧＡ４．１软件进行聚类分析，构建进化树由图３可知，Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ〔ＫＦ７２５６３６〕与Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ〔ＫＣ５０６７７８．１〕处于一个小分支，同时与另外两个枯草芽孢杆菌位于一个大分支由此，进一步说明拮抗菌株Ｂｓ０４为枯草芽孢杆菌２．３对其他病原真菌的拮抗作用为了研究拮抗菌株Ｂｓ０４的生防潜力，采用平板对峙法对其抑菌谱进行了测定结果说明，拮抗菌株Ｂｓ０４对供试病原真菌有较高的拮抗活性由表２可知，拮抗菌株Ｂｓ０４对辣椒疫霉菌、烟草疫霉菌的抑制率达７０％以上，对其他病原真菌的抑制率也在４０％以上说明菌株Ｂｓ０４的抑菌谱宽，生防潜力较大，具有良好的应用前景２．４对辣椒疫霉菌菌丝形态的影响由图４可知，用去离子水处理的辣椒疫霉菌丝形态饱满，细胞壁光滑，菌丝能正常生长并扩展〔图４ａ〕经拮抗菌株Ｂｓ０４菌体悬浮液和无菌滤液处理后，辣椒疫霉菌丝形态发生明显变化，菌丝分支增多，顶端出现畸形，生长缓慢〔图４ｂ与图４c〕；大多数菌丝还出现了细胞壁加厚，原生质浓缩呈球形或椭圆形的现象，菌丝中间出现许多类似厚壁孢子的细胞〔图４d〕。

３小结与讨论近年来，辣椒疫病发生日益严重，给中国的农业生产造成了较大的危害对于辣椒疫病的防治，长期以来使用化学农药进行防治，导致农药残留污染、增强病原菌的抗药性等不利影响辣椒疫病作为典型的土传病害，应用生防菌对其进行防治那么显得至关重要芽孢杆菌是一类重要的用于土传性病害的生防细菌多粘类芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌［８］等能够抑制多种病原菌的生长，对其引起的病害起到一定的防治作用枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，具有生长快、营养要求简单、对人畜无害、能够抑制多种植物病害、不易产生抗药性等优点，是目前应用广泛的生防菌［９］枯草芽孢杆菌能够有效抑制玉米串珠镰孢菌［１０］、棉花枯萎病菌［１１］、稻瘟病菌［１２］等，其抗菌谱较广本研究通过平板稀释法从辣椒根际土壤中别离到了枯草芽孢杆菌Ｂｓ０４，采用平板对峙法发现其对辣椒疫霉菌具有较强的拮抗作用，且对其他多种病原真菌具有明显的抑菌作用，具有较广的抗菌谱，这与前人的研究结果一致［１３－１５］同时，枯草芽孢杆菌Ｂｓ０４显著影响辣椒疫霉菌丝形态，能抑制菌丝的生长和扩展，阻止病原菌的进一步侵染枯草芽孢杆菌作为目前应用较为广泛的生防细菌之一，其主要通过根际定殖、分泌抗生素及拮抗蛋白等到达防病目的。

本研究中菌株Ｂｓ０４的防病机理有待进一步研究，而对于其在生产上的应用效果还有待于深入探索参考文献：［１］马晓飞，刘长远，赵奎华，等．辣椒疫病生防菌株鉴定及控病机理研究［Ｊ］．中国农学通报，２０１２，２８〔１０〕：１３６－１４１．［２］梅新兰，赵青云，谭石勇，等．辣椒疫病拮抗菌株筛选、鉴定及其防效［Ｊ］．应用生态学报，２０１０，２１〔１０〕：２６５２－２６５８．［３］ＬＩＵＨＸ，ＬＩＳＭ，ＬＵＯＹＭ，ｅｔａｌ．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆＲａｌｓｔｏｎｉａｗｉｌｔ，Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｂｌｉｇｈｔ，Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅｒｏｏｔ－ｋｎｏｔｏｎｂｅｌｌｐｅｐｐｅｒｂｙｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＡＲ１２，ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＳＭ２１ａｎｄＣｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．Ｒ８９［Ｊ］．ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１４，１３９〔１〕：１０７－１１６．［４］ＬＩＭＪＨ，ＫＩＭＳＤ．ＢｉｏｃｏｎｔｒｏｌｏｆＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｂｌｉｇｈｔｏｆｒｅｄｐｅｐｐｅｒｃａｕｓｅｄｂｙＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｐｓｉｃｉｕｓｉｎｇＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＡＨ１８ａｎｄＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＫ１１ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．JournalＫｏｒｅａｎＳｏｃＡｐｐｌＢｉｏｌＣｈｅｍ．２０１０，５３〔６〕：７６６－７７３．［５］赵斌，何绍江．微生物学实验［Ｍ］．北京：科学出版社，２００２．［６］东秀株，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册［Ｍ］．北京：科学出版社，２００１．［７］ＫＡＴＡＯＫＡＭ，ＵＥＤＡＫ，ＫＵＤＯＴ，ｅｔａｌ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎｉｎ１６ＳｒＤＮＡｔｏｃｒｅａｔｅａｎｉｎｄｅｘｆｏｒｒａｐｉｄｓｐｅｃｉｅｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｇｅｎｕｓＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ［Ｊ］．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，１９９７，１５１：２４９－２５５．［８］徐建宏，王建伟，胡晓丹，等．小麦赤霉病菌拮抗菌ＡＦ０９０７的别离鉴定及其拮抗特性［Ｊ］．江苏农业学报，２０１３，２９〔３〕：５１７－５２２．［９］ＡＳＡＫＡＯ，ＳＨＯＤＡＭ．ＢｉｏｃｏｎｔｒｏｌｏｆＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉｄａｍｐｉｎｇ－ｏｆｆｔｏｍａｔｏｗｉｔｈＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＲＢ１４［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｒｃｒｏｂｉｏｌ，１９９６，６２〔１１〕：４０８１－４０８５．［１０］ＢＡＣＯＮＣＷ，ＹＡＴＥＳＩＥ，ＨＩＮＴＯＮＤＭ，ｅｔａｌ．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆＦｕｓａｒｉｕｍｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅｉｎｍａｉｚｅ［Ｊ］．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＨｅａｌｔｈＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，２００１，１０９〔Ｓ２〕：３２５－３３２．［１１］曹君，高智谋，潘月敏，等．枯草芽孢杆菌ＢＳ菌株和哈茨木霉ＴＨ－１菌株对棉花枯黄萎病的拮抗作用［Ｊ］．植物病理学报，２００５，３６〔６〕：１７０－１７２．［１２］穆长青，刘雪，陆庆光，等．枯草芽孢杆菌Ｂ－３３２菌株对稻瘟病的防治效果及定殖作用［Ｊ］．植物保护学报，２００７，３４〔２〕：１２３－１２８．［１３］ＷＩＥＨＩＴＲＡＬ，ＰＵＮＰＥＮＨ，ＳＡＭＥＲＣＨＡＩＣ．ＧｒｏｗｔｈｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｓｔｒａｉｎｓａｎｄｔｈｅｉｒｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓａｇａｉｎｓｔｔｈｅｇｒｅｅｎｍｏｌｄｐａｔｈｏｇｅｎ〔ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｄｉｇｉｔａｔｕｍＳａｃｃ〕ｏｆｃｉｔｒｕｓｆｒｕｉｔ［Ｊ］．ＰｏｓｔｈａｒｖｅｓｔＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，４８〔１〕：１１３－１２１．［１４］ＥＥＭＡＮＭ，ＰＥＧＡＤＯＢＬ，ＤＵＦＲＮＥＹＦ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｎｔｈｅｉｎｔｅｆｆａｃｉａｌｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎｏｆｆｅｎｇｙｃｉｎ，ａｂｉｏａｃｔｉｖｅｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｌｌｏｉｄａｎｄＩｎｔｅｒｆａｃｅＳｃｉｅｎｃｅ，２００９，２９：２５３－２６４．［１５］ＣＨＵＮＧＳ，ＫＯＮＧＨ，ＢＵＹＥＲＪＳ，ｅｔａｌ．ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｐａｒｔｉａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＭＥ４８８ｆｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｏｉｌｂｏｒｎｅｐａｔｈｏｇｅｎｓｏｆｃｕｃｕｍｂｅｒａｎｄｐｅｐｐｅｒ［Ｊ］．ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏ，２００８，８０：１１５－１２３．。