肠杆菌科细菌替加环素耐药机制研究.docx

肠杆菌科细菌替加环素耐药机制研究肠杆菌科细菌，包括肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，是当今世界范围内出现的 引起院内感染的重要病原体替加环素因其良好的抗菌活性和临床使用的安全性, 是目前国内外用于应对碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌的首选抗菌药物近年来随着替加环素的广泛使用,关于肠杆菌科细菌替加环素耐药的报道逐 年增多，尤其是肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌对替加环素的耐药率也呈逐年上升趋 势，而现有的研究并不能合理解释肠杆菌科细菌对替加环素耐药的原因本研究 通过两部分内容,探讨了肠杆菌科细菌对替加环素耐药的主要机制，并深入探索 了肠杆菌科细菌替加环素耐药的新机制第一部分，主要研究产KPC肺炎克雷伯菌临床菌株对替加环素的敏感性以及 探索RND型外排泵在肺炎克雷伯菌替加环素耐药中所起的作用我们共收集了 215株产KPC肺炎克雷伯菌临床菌株,通过微量肉汤稀释法测定这些菌株的替加 环素最低抑菌浓度(MIC);挑选替加环素耐药菌株，使用外排泵抑制剂探讨外排泵 在这些菌株替加环素耐药中所起的作用;通过荧光定量PCR检测RND型外排泵基 因acrB和oqxB以及它们的转录调节因子(ramA、marA、soxS和rarA)的表达并 分析这些基因与替加环素MIC的相关性。

结果显示:215株产KPC肺炎克雷伯菌中有24株对替加环素耐药(MICN 4mg/L,EUCAST标准)，耐药率为11.2%而外排泵抑制剂NMP可有效恢复上述菌株 对替加环素的敏感性(91.7%的菌株恢复敏感)荧光定量PCR结果显示外排泵基因acrB的表达量与替加环素的MIC呈正相 关关系(P<0.05)此外，我们还在3株耐药菌株中发现ramA高表达现象，进一 步研究发现这些菌株均存在ramR突变对其中一株ramR突变引起基因表达终止的菌株进行野生型ramR回补，回补 后的菌株恢复对替加环素的敏感性，同时ramA和acrB的表达均受到抑制本研 究结果表明:RND型外排泵AcrAB-TolC在肺炎克雷伯菌临床菌株替加环素耐药中 起着关键的作用，它的表达量和细菌替加环素MIC呈正相关关系(P<0.05);同 时我们发现ramR基因的突变进而引起ramA基因和外排泵AcrAB的高表达是肺炎 克雷伯菌临床菌株替加环素耐药的主要机制之一第二部分,通过基因敲除、体外诱导等技术探索了大肠埃希菌替加环素耐药 的新机制我们利用Red重组系统，进行基因敲除以标准菌株大肠埃希菌ATCC 25922为亲本菌株，构建了大肠埃希菌外排泵 AcrAB敲除株25922AacrAB,然后以ATCC 25922和25922AacrAB为亲本菌株进 行替加环素体外诱导实验，获得耐药菌株25922AacrAB-TGC8和25922-TGC8。

对 耐药菌株和亲本菌株进行全基因组测序，并通过比较基因组学数据分析方法寻找 突变基因，发现在25922AacrAB-TGC8和25922-TGC8中均存在mlaA基因突变， 而随后的基因敲除和回补实验亦证明mlaA基因的突变可以导致大肠埃希菌替加 环素的MIC升高8倍进一步研究表明，在菌株25922-TGC8中该细菌对替加环素耐药是Mla系统、 外排泵AcrAB和核糖体蛋白变异三种机制共同作用的结果，最终使菌株对替加环 素的MIC从0.125mg/L上升到8mg/L(FDA耐药标准)因为Mla系统、外排泵AcrAB 和核糖体蛋白均由细菌染色体编码，当细菌在替加环素药物选择压力的作用下， 上述基因易发生突变，进而导致替加环素耐药的发生，可能是对肠杆菌科细菌在 替加环素治疗过程中容易从敏感发展成为耐药较为合理的解释。