实验用禽（鸡、鸭）-遗传质量控制标准.docx

DB31上 海 市 地 方 标 准实验用禽（鸡、鸭）-遗传质量控制标准（征求意见稿）Experimental poultry (chicken and duck) -Genetic quality control standard上海市市场监督管理局前 言本标准按照GB/T 1.1-2020给出的规则起草本标准由上海市科学技术委员会办公室提出并归口本标准起草单位：上海实验动物研究中心、中国农业科学院上海兽医研究所、上海市农业科学院畜牧兽医研究所本标准主要起草人：赵勇、胡建华、魏晓锋、陈鸿军、范春、陈国强、孙竹筠、罗新霞、陈永军、刘惠莉实验用禽（鸡、鸭）-遗传质量控制标准（草案）实验用禽（鸡、鸭）-遗传质量控制标准（草案）1 范围 本文件规定了实验用禽（鸡、鸭）的繁殖和遗传质量监测方法 本文件适用于封闭群鸡和鸭以及MHC单倍型鸡群和鸭群遗传质量控制2 规范性引用文件 下列文件对于本标准的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用本部分，鼓励根据本标准达成协议的各方，研究是否可以使用这些文件的最新版本凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB 14923-2010 实验动物 哺乳类动物的遗传质量控制 DB13/T 804-2006 鸡住白细胞原虫病防治技术规程 DB32/T 2130-2012 普通级实验用鸡 饲养管理规范3 术语和定义3.1 家禽 poultry指人工豢养的鸟类动物，主要为了获取其肉、卵和羽毛，也有作为其他用处一般为雉科和鸭科动物，如鸡、鸭、鹅等，也有其他科的鸟类如火鸡、鸽、鹌鹑和各种鸣禽本标准中家禽仅包含鸡、鸭3.2 封闭群 closed colony 以非近亲交配方式进行繁殖生产的种群，在不从其外部引入新个体的条件下，至少连续繁殖4代以上，群体的基因频率达到稳定，每代近交系数增加不超过1%3.3 单倍型 haplotype 单倍体基因型的简称，也叫单体型，在遗传学上是指在同一条染色体上紧密连锁的多个基因或遗传标记构成的基因型3.4 主要组织相容性复合体 major histocompatibility complex(MHC)主要组织相容性复合体是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称它与免疫识别、排斥和免疫应答有关，在一定程度上决定动物个体对疫病的易感性或抗性3.5 杂合度 heterozygosity杂合度又称群体的平均杂合性，它是群体遗传变异的另一个度量参数，是指某一基因座上的等位基因是杂合体的频率。

期望杂合度（He）主要是根据种群类当前优势等位基因的分布频率来推算的杂合度，观测杂合度（Ho）是随机抽取的两个样本的等位基因不相同的概率，即观察到的杂合子比例3.6 基因频率 genotype frequency基因频率是指，一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率4 繁殖方法 4.1 封闭群 4.1.1 种禽必须遗传背景明确或来源清楚，有较完整的资料（包括来源、品系名称、日期及主要生物学特征等）4.1.2 封闭群繁殖的原则是尽量保持基因异质性及多态性，避免近交系数随繁殖代数增加而过快上升4.1.3 各家系之间采用最佳避免近交法、循环交配或随机交配法，每代近交系数上升不超过1%4.1.4 种群的雄雌个体比例一般为1:8～1:10 4.2 MHC单倍型4.2.1 种禽的MHC核心区域保持单倍型纯合4.2.2 繁殖原则是保持MHC核心区域的基因纯合性4.2.3 以全同胞或半同胞兄妹交配方式进行繁殖4.2.4 雄雌个体比例一般为1:8～1:105 遗传质量监测 5.1 封闭群的检测5.1.1 抽样种群规模不大于100只的，随机抽取25只，雌雄不限，进行检测规模大于100只的随机选取15%的比例，最多不超过30只。

5.1.2 检测方法5.1.2.1 封闭群鸡采用微卫星分子标记检测方法，具体方法采用附录A5.1.2.2 封闭群鸭采用微卫星分子标记检测方法，具体方法采用附录B5.1.3 群体评价 群体内遗传变异采用期望杂合度进行评价　　5.1.4 检测频率封闭群每个世代至少1次遗传质量检测5.1.5 结果判定根据基因频率判断，基因频率保持稳定，判定合格5.2 MHC单倍型禽的检测5.2.1 抽样种群规模不大于100只的，按10%的比例抽样；种群规模大于100只的，按照25%的比例抽样，雌雄、日龄不限5.2.2 检测方法5.2.2.1 MHC单倍型鸡：采用聚合酶链式反应（PCR）法扩增MHC基因核心区域片段，然后进行Sanger测序和序列分析，具体方法见附录C5.2.2.2 MHC单倍型鸭：采用聚合酶链式反应（PCR）法扩增MHC基因核心区域片段，然后进行Sanger测序和序列分析，具体方法见附录D5.2.3 检测频率 每个世代至少1次遗传质量检测5.2.4 结果判断5.2.4.1 MHC单倍型鸡：所有样本序列与国际标准序列对比，同源性达100%，判为合格5.2.4.2 MHC单倍型鸭：测序结果与标准序列完全一致，判为合格。

附录A 封闭群鸡微卫星DNA标记检测方法A.1 基因组DNA提取 翅静脉采集血样（柠檬酸钠抗凝血），采用常规的酚-氯仿抽提提取基因组DNAA.2 微卫星DNA标记 根据联合国粮农组织（FAO）推荐的用于鸡遗传多样分析的15对微卫星标记，引物进行荧光素标记依据荧光素将所有引物分成3个组合，同组合内的位点可同时检测引物信息见表A.1表A.1 引物信息组合标记引物序列（5→3）片段大小（bp）荧光标记退火温度（℃）AADL0268CTC CAC CCC TCT CAG AACTACAA CTT CCC ATC TAC CTA CT112-116FAM60ADL0278CCA GCA GTC TAC CTYT CCTATTGT CAT CCA AGA ACA GTGTG112〜122HEX60LEI0094GAT CTC ACC AGT ATG AGC TGCTCTCAC ACT GTAACA CAG TGC246-262FAM58MCW0216GGG TTT TAC AGG ATG GGACGAGT TTC ACT CCC AGG GCT CG146-148FAM60MCW0248GTT GTT CAA AAG AAG ATG CAT GTTGCAT TAA CTG GGC ACT TTC214-218FAM61MCW0069GCA CTC GAG AAA ACT TCC TGCGATT GCT TCAGCA AGC ATG GGA GGA156-170HEX59BMCW0081GTT GCT GAG AGC CTG GTG CAGCCTGTA TGT GGA ATT ACT TCT C114-134FAM58MCW0222GCA GTT ACA TTG AAA TGA TTC CTTCTCAAAA CAC CTA GAA GAC219-221FAM58MCW0295ATC ACT ACA GAA CAC CCT CTCTATGTA TGC ACG CAG ATA TCC88〜100FAM62LEI0166CTC CTG CCC TTA GCT ACG CATAT CCC CTG GCT GGG AGTTT345-355FAM60LEI0234ATG CAT CAG ATT GGT ATT CAACGT GGC TGT GAA CAAATATG217-299HEX58MCW0037ACC GGT GCC ATC AAT TAC CTA TTAGAAAGC TCA CAT GAC ACT GGG AAA151-155FAM59MCW0111GCT CCA TGT GAA GTG GTTTAATG TCC ACT TGT CAA TGATG99-107FAM55MCW0016ATG GCG CAGAAG GCAAAG CGATATTGG CTT CTG AAG CAG TTG CTA TGG143-147HEX57CLEI0258TCGGGAAAAGATCTGAGTCATTGTGATTTTCAGATCGCGTTCCTC206-555FAM58 A.3 PCR 反应体系 反应程序为：95℃ 5min；94℃ 30s，50℃~64℃ 30s，72℃ 30s，30~35个循环；72℃ 10min；4℃保存。

PCR反应体系见表A.2表A.2 封闭群SPF鸡遗传质量检测PCR反应体系试剂数量（μL）浓度10buffer1.51.5 mmol/LdNTP1.22.5 mmol/|LPrimer mix0.2510 pmol|LDNA template250 ng/LTaq polymerase0.252.5 U/LddH209.8—共计15—A.4 PCR产物的检测用灭菌去离子水将PCR扩增产物适量稀释取稀释产物2 μL和含分子量标准的上样缓冲液8 μL混合，95℃变性5 min，立即置于冰上5 min后，在ABI3130 DNA测序仪上选择 Data Collection程序，电泳，收集荧光信号，形成胶图应用GeneMapper软件进行数据提取、分子量标准设定和PCR产物片段大小的计算，判定基因型A.5 数据分析采用Excel Microsatellite Toolkit （version 3.1）软件计算群体内的期望杂合度（He），主要是根据种群内当前优势等位基因的分布频率来推算， 式中r为位点数，Pi为每个位点第i个等位基因的频率，ni为第k个位点的等位基因数目附录B 封闭群鸭微卫星DNA标记检测方法B.1 基因组DNA提取采用常规酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。

B.2 PCR反应体系（附表B.1）表B.1 封闭群SPF鸭PCR反应程序组分用量(L)终浓度10Taq Buffer1.501.50 mmol/LdNTP1.502.50 mmol/LPrimer Mix0.2510.00 pmol/LTap Polymerase0.302.50 U/LDNA Template1.50100.00 ng/LddH2O10.00—总体积15.00—反应条件：95℃ 5 min；94℃ 30 s，50℃～64℃ 30 s，72℃ 30 s，30～35个循环；72℃ 10 min；4℃保存B.3 PCR产物检测 取5 L PCR产物与1 L 6上样缓冲液混匀，根据其产物。