引物设计常见问题与解答.docx

引物设计常见问题与解答先看一下 Tm 的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature.The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.引物设计软件都可以给出Tm,引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。

长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4°C(G + C)+ 2°C(A + T)对于更长的寡聚核苷酸， Tm 计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) - 600/size公式中， Size = 引物长度Tm叫溶解温度(melting temperature, Tm)，即是DNA双链溶解所需的温度大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是 没有作用的因此，对于引物的Tm,只有和模板互补的区域对Tm才有贡献计算Tm 时，只计算互补的区域(除非你的酶切位点也与模板互补)不少战友设计的引物都Tm过 低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了 PCR 反应的诸多困难所以，设计引物的时候，先不管5'端的修饰序列，把互补区的Tm控 制 在55度以上(我喜欢控制在58以上，具体根据PCR的具体情况，对于困难的PCR，需 要适当提高Tm)，再加上酶切位点和保护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小 的问题，也可以挽回Tm温度高的引物就比较容易克服3、发卡、二聚体及3'非特异结合 等问题。

简单的计算公式可以用2+4的公式若你计算的Tm值达到了快90，不包括 酶切位点引物公司给你发的单子是包括酶切位点的自己可以再估计一下如你设计了带 酶切位点的引物，总长分别为29、 33个碱基，去掉酶切位点 和保护碱基，分别为17、 21个碱基引物公司给的单子是70多度，实际用的只有50度，用55度扩的结果也差不 多其它关于Tm值的计算，有用PP5.0进行评价的，需要考虑的参数包括：base number、 GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer一般退火温度为 Tm-5 度，退火温度的计算可以不把加入的酶切位点及保护碱基考虑进去，如上所言，PCR几个 循环后，引物外侧的序列已经参入 了扩增片断中，所以你可以在预变性后多加几步，温度 比你Tm值低些（这样可能会增加非特异性）,Tm值是你包括酶切位点及保护碱基的Pr ime r 计算出来的1.一般在5'端加保护碱基，如果你扩增后把目的条带做胶回收转入T-ECTOR 或者其它的载体的话,酶切时可以不需加保护碱基2.有人的经验加入酶 切位点的引物可以 和未加入时使用相同的退火温度,结果也还是令人满意上面是我以前在园子里看到的精彩的帖子，所以收藏了一下.上面说的比较明白.如果加上酶 切位点和保护碱基，计算出来的Tm 一般教高,而我们设的退火温度原则是Tm-5,一般都是 用55度左右，所以我坚持我的观点.不要算进去。

1. 引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法 DNA 合成仪有很多种, 主要都是由 ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的 高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少申能博彩公司采用的合成仪主要 机型为 ABI3900高通量合成仪，合成长链主要采用Beckman 1000M和PE8909 DNA合成仪， 引物修饰和高 OD 数合成采用 ABI394 等亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特 点亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由 待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'-5'磷酸二酯键连接第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱 去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷 亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基 发生缩合反应第三步，带帽（capping）反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应（少于 2%），用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上再以三氯乙酸脱去 它的5'-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去合 成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引 物，成品引物用C18浓缩，脱盐，沉淀沉淀后的引物用水悬浮，测定OD26O定量，根据 定单要求分装2. 引物纯化方式有哪些，如何选择？.C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解 洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分它不能有效去除比目的片段短的小片段 实际上，它是一种脱盐的作用这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响对于需要用 于测序、克隆的引物不能使用这个级别OPC纯化：OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge柱中树脂间的 亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段OPC法纯化的DNA纯度大于95%适用于 40mer 以下引物的纯化PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离， 然后从凝胶中回收目的DNA的方法。

PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法， 纯化后的DNA纯度大于95%，对长链Oligo DNA （大于50mer）的纯化特别有效HPLC纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化纯度 可以大于99%主要用于短链和修饰引物的纯化该法的弱点是成本较高，批量生产效率 不高3■引物的OD数如何定量？答：引物合成引物OD数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm,石英比色 杯，光程为 1 厘 米，测定溶液的光密度测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0 之间 DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD值需要根据 稀释倍 数换算出母液的 OD 值4.投诉定量不准是怎么回事儿？答：我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告，出现这种情况的可能性有（1）生产人员 定量错误这种可能 性有，但是不大，因为我们的生产人员都是经过严格的培训，程序化 规范操作和换算公司内部的考核机制也使得分装人员没有必要故意少给用户OD数，因 为无论OD数是否达到定单要求，我们都统计为工作量，没有达到OD数的，分装人员将 清单及时报到序列录入部门安排重合就可以了合成产量的高低是序列录入部门人 员的考 核指标之一。

一般情况下，引物都有留样接到用户投诉后，我们都会找出留样重新定量， 一般都没有问题2）分装没有问题，但引物抽干或收样过程 中，引物干粉可能意外丢 失这种情况很少见3）系统误差，我们认为 10%左右为允许误差使用过程中，引 物工作浓度范围很宽，定量上的少许偏差不影响 实验4）用户没有能够正确理解引物 OD数的含义，没有能够正确使用分光光度计，特别是使用微量测定;用户没有将OD读数， 正确地转换成母液中 OD 数 这种情况比较常见5）用户收到引物干粉时，打开引物 管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失例如，验证标2OD引物量是否准确，简单的做法是：加入1ml水，彻底溶解混匀 后，取100ul,加入900ul水，用光径为1cm的石英比色杯，波长260nm,此时光吸收 的读数为 0.2 5.需要什么级别的引物？答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化根据实验需要，确定订购引物的纯度级别应用引物长度要求纯度级别要求一般PCR扩增< 45baseOPC>45 basePAGE诊断PCR扩增< 40baseOPC, PAGEDNA测序20base左右OPC亚克隆，点突变等根据实验要求定OPC, PAGE，HPLC基因构建（全基因合成）根据实验要求定PAGE反义核酸根据实验要求定PAGE修饰引物根据实验要求定PAGE, HPLC6.最长可以合成多长的引物？答：引物越长，出现问题的概率就越大。

我们合成过120base的引物，但是产率很低 除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗产 品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理还有丢失很 多，最后 的产量是很低7■需要合成多少OD数？答：根据实验目的确定一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标准 PCR反应如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了但是有些研究人员，就做 几次PCR，但是却要5-10 OD做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也 要求高OD数片段越长，最后全长得率就越低，出错的几率就越大超出需要之外的OD 数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是 新手的自 信心不足，总觉得需要重复多次才能成功8.如何检测引物的纯度？答：实验室方便的作法是用PAGE方法使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶 进行电泳取0.2-0.50D的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和， 上样前加热变性（95°C,2mi ns）加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加 样600V电压进行电泳，一定时间后（约2-3小时），剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检 测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。

如果条件许可，也可以用EB染色或银 染方式染色9.如何计算引物的浓度？答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定引物一般配制成10-50pmol/ul溶解前 您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致如果不一致，请和我们联系 我们可以根据生产记录查到实际产量是多少一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列 方式计算：V （微升）=OD数* （乘）33 * （乘）* （乘）20000 / （除）引物的分子量 引物的分子量可以从合成报告单上获得如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算注意： 1 OD260= 33 ug/m。