尖萼耧斗菜的进化生物学研究.doc
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尖萼耧斗菜的进化生物学研究- 1 -尖萼耧斗菜的进化生物学研究史凤雪 李志瑞 崔娜 谭判 吕雪 杜爽 鲁晶 王璞 李松柏（东北师范大学生命科学学院，吉林 长春 130024）摘要：尖萼耧斗菜（Aquilegia oxysepala Trautv.et C.A.Mey.）隶属于毛茛科（Ranuncuaceae）耧斗菜属（Aquilegia），为多年生草本，广泛分布于朝 鲜半岛、俄罗斯东南部和我国东北地区在本实验中，我们分别对尖萼耧斗菜及其 变种黄花尖萼耧斗菜进行传粉生物学与分子生物学研究，以期望揭示花色的差异对尖萼耧 斗菜和变种黄花尖萼耧斗菜传粉行为与遗传结构的差异通过传 粉生物学的研究发现，尖萼 耧斗菜及其变种黄花尖萼耧斗菜的传粉者传粉方式已出现分化，而通过分子实验也验证了其 遗传结构存在了分化， 这为将来进一步研究其物种形成奠定了基础关键词：毛茛科 尖萼耧斗菜 传粉生物学 分子生物学 遗传结构1 背景介绍尖萼耧斗菜（Aquilegia oxysepala Trautv.et C.A.Mey.）隶属于毛茛科（Ranuncuaceae ）耧斗菜属（Aquilegia ） 该属共有约 70种，广泛分布于欧洲、北美洲与亚洲等地区 【1】 。
多年生草本植物，全草可人药，具有通经、活血散瘀的功效在我国主要分布于黑龙江、吉林和辽宁省等地区，其主要生长于海拔450－l000米的山地杂木林边和草地中 【2,3】 尖萼耧斗菜种内包括尖萼耧斗菜和变种黄花尖萼耧斗菜其中，黄花尖萼耧斗菜是尖萼耧斗菜的一个变种花瓣尖端为黄色，下端延伸的距和萼片为紫红色的为紫花尖萼耧斗菜；花瓣、距及萼片均为黄白色的为黄花尖萼耧斗菜尖萼耧斗菜生于林下、林缘及山麓草地，广泛分布于朝鲜、俄罗斯及我国东北经实地调查发现，在我国东北黑龙江省以紫花尖萼耧斗菜为主，辽宁省以黄花尖萼耧斗菜为主，而吉林省两种均有分布由此可知，尖萼耧斗菜是研究物种形成与适应性分化的优良材料因此，在本实验的研究中我们分别从传粉生物学与分子生物学角度对尖萼耧斗菜与黄花尖萼耧斗菜进行研究传粉生物学的研究不仅对理解物种的繁育系统、居群的遗传结构、物种分化、种群的生态特征均具有重要意义，同时也为研究协同进化和生物地理区系分布提供着直接和必不可少的证据，是目前进化生物学和生物地理学研究的热点之一 【4】 植物的进化不仅受到自身基因结构的影响，还受到外界环境对植物的选择作用，除了气候、地理条件等因素外，传粉尖萼耧斗菜的进化生物学研究- 2 -动物与显花植物之间的协同进化也是影响植物进化的重要因素。
传粉动物对显花植物的影响主要表现在以下几个方面：传粉动物在活动时间和地理分布上的差异；传粉动物对花朵形态、颜色或气味上的选择性差异；传粉动物对花粉或花蜜等物质的采食性差异；传粉动物在体型和数量上的差异显花植物与传粉动物之间通过长时间的选择和适应，逐步形成一整套相互获利的生存机制和进化特征，彼此建立了一系列专一或不完全专一的依赖关系，显花植物在对花器官的调整来适应传粉动物传粉行为的过程中经过长时间的驯化，就有可能在基因结构上发生改变，从而有别于原有物种，进而产生生殖隔离形成新物种由上可知，传粉系统在物种进化的过程所扮演的重要角色而近年来随着分子技术的不断革新与推广，各种分子标记技术都逐渐被引入到了生物学的研究中例如，扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)、简单重复序列（Simple Sequence Repeat, SSR）单核苷酸多态性 （Single Nucleotide Polymorphism, SNP）等这些现代分子标记技术的引入使得物种进化领域的研究取得了突出的成果，同时也为传粉生物学的研究提供强有力的分子证据。
耧斗菜因其表型的多样性、生境分布的广泛性，是研究适应辐射进化的理想材料，成为近期遗传学、染色体组学和基因组学研究的焦点，学者们旨在将物种发展为生态与进化研究的模式植物 【1】 在长白山地区主要存在紫色与黄色两种颜色的尖萼耧斗菜，它们在颜色形态上已有差别，本实验旨在通过对两种颜色的尖萼耧斗菜进行传粉生物学研究和分子实验研究，根据传粉者的不同及其传粉时间段的不同以及在其 DNA 序列上的碱基差异推断两种颜色的尖萼耧斗菜在物种进化上的关系，从而为进化生物学提供新的例证同时，耧斗菜属植物的花部性状具有丰富的多态性，而且这些性状与传粉生物学密切相关，对进一步研究进化生物学具有重要意义2 方法与实验2.1 传粉生物学实验2.1.1 研究区域：选取长白山地区的尖萼耧斗菜及其变种黄花尖萼耧斗菜，在 7 月上旬对部分尖萼耧斗菜进行套袋处理，对尖萼耧斗菜集中的区域进行传粉者观察2.1.2 套袋实验的设计方案：通过探究尖萼耧斗菜及其变种黄花尖萼耧斗菜自交是否可育或者可育程度是否有差异，来研究其是否在进化上产生分化7 月 3 日在长白山地区山腰处对紫花和黄花尖萼耧斗菜植株上的一些未开放的花朵进行套袋处理（即用茶包将待放的花朵套住，避免传粉昆虫对花的干扰） ，其中紫花套袋处理 6 朵，黄花 2 朵。
九天后取下经套袋处理的果实和一些未套尖萼耧斗菜的进化生物学研究- 3 -袋处理的果实，对比二者结实率2.1.3 观察传粉过程的方法：对尖萼耧斗菜及其变种黄花尖萼耧斗菜分别进行观察、拍照并以 30 分钟为一个时间段进行记录，主要记录传粉动物的种类、数量、传粉方式（取食花蜜或花粉）以及在不同时间段造访两类花朵的频度汇总观察到的数据，通过作折线统计图和饼图得出两种颜色尖萼耧斗菜传粉者的差异，进而分析两种尖萼耧斗菜在传粉生物学上的差异2.2 分子生物学实验2.2.1 DNA 的提取与样品的编号对所采集的尖萼耧斗菜用试剂盒法提取 DNA，所用试剂盒为康为世纪（CWBIO）产品，按该试剂盒内所附说明书进行 DNA 提取，所选样品的编号及信息见表 1表 1 样品编号与信息样品编号 花色 采集地点 采集人 采集时间D44 黄色 冰浴沟 李志瑞 2011 年 7 月 5 日D45 黄色 冰浴沟 李志瑞 2011 年 7 月 5 日D46 黄色 冰浴沟 李志瑞 2011 年 7 月 5 日D47 黄色 冰浴沟 李志瑞 2011 年 7 月 5 日D48 黄色 冰浴沟 李志瑞 2011 年 7 月 5 日D60 紫色 敦化 李松柏 2011 年 7 月 12 日D61 紫色 敦化 李松柏 2011 年 7 月 12 日D62 紫色 敦化 李松柏 2011 年 7 月 12 日D63 紫色 敦化 李松柏 2011 年 7 月 12 日D64 紫色 敦化 李松柏 2011 年 7 月 12 日D70 黄色 五常 李志瑞 2011 年 7 月 5 日D71 黄色 五常 李志瑞 2011 年 7 月 5 日D73 紫色 林口 李志瑞 2011 年 7 月 10 日D74 紫色 林口 李志瑞 2011 年 7 月 10 日D75 紫色 林口 李志瑞 2011 年 7 月 10 日D76 紫色 林口 李志瑞 2011 年 7 月 10 日D77 紫色 林口 李志瑞 2011 年 7 月 10 日D78 黄色 老白山 李志瑞 2011 年 7 月 8 日D79 黄色 老白山 李志瑞 2011 年 7 月 8 日尖萼耧斗菜的进化生物学研究- 4 -D80 黄色 老白山 李志瑞 2011 年 7 月 8 日D90 紫色 冰浴沟 李志瑞 2011 年 7 月 5 日D91 紫色 冰浴沟 李志瑞 2011 年 7 月 5 日D92 紫色 冰浴沟 李志瑞 2011 年 7 月 5 日D93 紫色 冰浴沟 李志瑞 2011 年 7 月 5 日D94 紫色 冰浴沟 李志瑞 2011 年 7 月 5 日D95 黄色 五常 李志瑞 2011 年 7 月 7 日D96 黄色 五常 李志瑞 2011 年 7 月 7 日D97 黄色 敦化 李松柏 2011 年 7 月 12 日D98 黄色 敦化 李松柏 2011 年 7 月 12 日D99 黄色 敦化 李松柏 2011 年 7 月 12 日2.2.2 PCR 与检测 对所提取的基因组 DNA 用设计好的 SSR 引物进行荧光 PCR 扩增，所用 SSR 引物来源于 Li et al 【5】 中的 5 对 A6、A7 、AA12、AA4、EST7。
本实验所用 PCR 仪的型号为Gene company Limited 公司的 GeneAmp PCR 仪 2720 型PCR 反应的体系为ddH2O14.4µL、10buffer(含 Mg2+) 2µL、正引物 0.3µL、反引物 0.6µL、M 13F 引物0.15µL、M 13F 荧光引物 0.15µL、Taq 酶 0.2µL、DNA2µLPCR 反应程序为：95℃,5min;94℃,30s,50℃,30s,72℃,30s,35 个循环;72℃,8min然后将 PCR 产物于 1.5g/L 琼脂糖凝胶电泳中检测后使用 ABI3730（ABI，USA）测序仪进行检测3 实验结果3.1 传粉实验结果3.1.1 套袋的结果对于套袋处理的尖萼耧斗菜，统计其结实率发现紫花植株经套袋处理后，自交不育率较高（80.3%） ，而且自交结实率（ 85.0%）也明显低于自然生长状态下的结实率黄花植株经套袋处理后，自交不育率较紫花种类为低（50%） ，而且结实率与自然状态下没有太大差别3.1.2 传粉结果通过实地观察获得尖萼耧斗菜及其变种黄花尖萼耧斗菜传粉者的信息，利用饼图绘制各传粉者的比例，利用折线统计图绘制传粉者的访问高峰期并对比两种尖萼耧斗菜传粉者的访问高峰期，如图 1、2、3、4、5。
尖萼耧斗菜的进化生物学研究- 5 -图 1.紫 色 花 各 传 粉 者 所 占 比 例10%77%5% 8%熊 蜂黑 胡 蜂蚜 蝇蜜 蜂图 2.黄 色 花 各 传 粉 者 所 占 比 例12%56%5%23%4%熊 蜂黑 胡 蜂蚜 蝇蜜 蜂未 知 蝇图 3.紫 色 花 传 粉 者 访 问 高 峰 期024681012148:00-8:308:30-9:009:00-9:309:30-10:0010:00-10;3010:30-11:0014：30-15： 0015：00-15： 3015：30-16:0016:00-16:30时 间数量熊 蜂黑 胡 蜂蚜 蝇蜜 蜂尖萼耧斗菜的进化生物学研究- 6 -图 4.黄 色 花 传 粉 者 访 问 高 峰 期024681012148:00-8:308:30-9:009:00-9:309:30-10:0010:00-10;3010:30-11:0014：30-15： 0015：00-15： 3015：30-16:0016:00-16:30时 间数量熊 蜂黑 胡 蜂蚜 蝇蜜 蜂未 知 蝇图 5.黄 花 与 紫 花 传 粉 者 高 峰 期 对 比02468101214168:00-8:308:30-9:009:00-9:309:30-10:0010:00-10;3010:30-11:0014： 30-15：0015： 00-15：3015： 30-16:0016:00-16:30时 间数量 黄 花紫 花3.2 分子实验结果对紫花和黄花尖萼耧斗菜各 15 个个体进行 PCR 扩增以后，用测序仪检测后对所得数据用生物软件 populations-1.2.32 分析处理后作成进化系统谱系图，见图 6。
尖萼耧斗菜的进化生物学研究- 7 -紫色 （林口）D73紫色（林口）D74 紫色（林口）D75 紫色（林口）D76 紫色（林口）D77紫色（冰浴沟）D91 紫色（冰浴沟）D92黄色（敦化）D99 黄色（冰浴沟）D48 黄色（五常）D71紫色（敦化）D60 紫色（敦化）D62 紫色（敦化）D63 紫色（敦化）D64 紫色（冰浴沟）D90 紫色（冰浴沟）D93 紫色（冰浴沟）D9。
