药典 H无菌检查法.docx

II - M H无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他 品种是否无菌的一种方法若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品 在该检验条件下未发现微生物污染无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域 内或隔离系统中进行，其全过程中必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染 单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、 浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证隔离系统按相 关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求培养基培养基的制备培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基 配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌制备好的培养基应保存在2〜25笆、避 光的环境培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭 容器中，一般可在一年内使用1、硫乙醇酸盐流体培养基（用于培养好氧菌、厌气菌）酪胨（胰酶水解）15g ；氯化钠2.5g ；葡萄糖5g ；新配制的0.1%刃天青溶 液1.0ml ； L-胱氨酸0.5g （或新配制的0.2%亚甲蓝溶液0.5ml ）；硫乙醇酸钠0. 5g ；琼脂0.75g （或硫乙醇酸0.3ml ）；水1000ml ；酵母浸出粉5g除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解后，调节pH为弱碱 性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2，分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基 氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。

灭菌在供试品接种前，培养基氧 化层的高度不得超过培养基深度的1/5 ,否则，须经100 °C水浴加热至粉红色消 失（不超过20分钟）迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染硫乙醇酸盐流体培养基置30〜35 C培养• 2、改良马丁培养基（用于培养真菌）胨5g ；磷酸氢二钾1g ；酵母浸出粉2g ；硫酸镁0.5g ；葡萄糖20g ；水100 0ml除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH值约为6.8，煮沸，加入 葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌改良马丁培养基置23〜28 C培养• 3、选择性培养基按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭 菌或使用前加入适量的中和剂或表面活性剂，如对氨基苯甲酸（用于磺胺类供 试品）、聚山梨酯80 （用于非水溶性供试品）或p -内酰胺酶（用于p -内酰胺类 供试品）等中和剂或表面活性剂的用量应通过验证• 4、营养肉汤培养基胨10g ；牛肉浸出粉3.0g ；氯化钠5g ；葡萄糖5.0g ；水1000ml取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使 灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。

• 5、营养琼脂培养基按上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入14.0g琼脂，调节pH值使灭菌 后为7.2±0.2，分装，灭菌• 6、0.5%葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查）胨10g ；葡萄糖5g ；氯化钠5g ；牛肉浸出粉3.0g ；水1000ml除葡萄糖外取上述成分混合，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，加葡 萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌• 7、改良马丁琼脂培养基按改良马丁培养基的处方及制法，加入14.0g琼脂，调节PH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌培养基的适用性检查无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无 菌性检查及灵敏度检查的要求本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的 无菌检查同时进行无菌性检查每批培养基随机不少于5支（瓶），培养14天，应无菌生长灵敏度检查培养基灵敏度检查法1. 菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存 中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试 验菌株的生物学特性• 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） [CMCC（B） 26 003]• 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC (B) 10 104]•枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ) [CMCC (B) 63 501]• 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) [CMCC (B) 64 941]•白色念珠菌(Candida albicans) [CMCC (F) 98 001]• 黑曲霉(Aspergillus niger ) [CMCC (F) 98 003]菌液制备：接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养 物至营养肉汤获营养琼脂培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐 流体培养基中，30〜35 °C培养18〜24小时；接种白色念株菌的新鲜培养物至改 良马丁培养基或改良马丁培养基中，23〜28 C培养24〜48小时，上述培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu (菌落形成单位)的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23〜28 C培养5〜7 天，加入3〜5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱然后，吸出孢子悬液(用 管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内，用0. 9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液培养基接种：取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种 小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2 支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培 养基5支，分别接种小于100cfu的白色念株菌、黑曲霉各2支，另1支不接种 作为空白对照，培养5天逐日观察结果结果判断：空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管菌生长良好，判该培 养基的灵敏度检查符合规定稀释液、冲洗液及其制备方法稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌1.0.1%蛋白胨水溶液：取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，调 节PH值至7.1±0.2，分装，灭菌2.PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、 氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。

如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和 剂等方法验证或试验当建立药品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合 于该药品的无菌检查若药品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重 新验证验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作对每一对试验 菌应逐一进行验证菌种及菌液制备：同培养基灵敏度检查薄膜过滤法：将规定量的供试品薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗 液中加入小于100cfu的试验菌，过滤取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基 或改良马丁培养基中，或将培养基加至滤筒内另取一装有同体积培养基的容 器，加入等量试验菌，作为对照按规定温度培养3〜5天各试验菌同法操作直接接种法：取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8 管，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、 生孢梭菌各2管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管， 分别接入小于100cfu的白色念株菌、黑曲霉各2管其中1管接入规定量的供 试品，另1管作为对照品，按规定的温度培养3〜5天结果判断：与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供 试品的该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检 查条件进行供试品的无菌检查。

如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓 慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲 洗量，或增加培养基的用量，或使用中和剂或灭活剂如B-内酰胺酶、对氨基苯 甲酸，或更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证方法验证试验夜可与供试品的无菌检查同时进行供试品的无菌检查检验数量：检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量除另有 规定外，出厂产品按表1规定；上市产品监督检查按表2、表3规定表1、表2、表3中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量一般情况下，供试 品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量作阳性对照用；若采 用直接接种法，应增加供试品1支（或瓶）作阳性对照用检验量：使指一次试验所用的供试品总量（g或ml）除另有规定外，每份 培养基接种供试品的量按表2、表3规定采用直接接种法时，若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基 和改良马丁培养基采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法的供试品 总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤阳性对照：应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阴性菌 为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照 菌；抗真菌的供试品，以白色念株菌为对照菌。

阳性对照试验的菌液制备同培 养基灵敏度检查（大肠埃希菌的菌液制备同培养基的灵敏度检查中的金黄色葡 萄球菌），加菌量小于100cfu，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种 的样品量阳性对照管培养48〜72小时应生长良好阴性对照：供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液同法操作，作为阴性 对照阴性对照不得有菌生长无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其 有效性，且对微生物生长及存活无影响无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法只要供试品性状允许，应采用薄 膜过滤法进行供试品无菌检查时，所采用的检查方法和检验条件应与验证的 方法相同操作时，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒如果容器内有一 定的真空度，可用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头），向供试品容 器内导入无菌空气，再按无菌操作开启容器取出内容物供试品处理及接种培养基除另有规定外，按下列方法进行1.薄膜过滤法薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器，也可使用一般薄膜过滤器无菌 检查用的滤膜孔径应不大于0.45um，直径约为50mm根据供试品及其溶剂的 特性选择滤膜材质滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌使用时，应保 证滤膜在过滤前后的完整性。

水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜油类供试品，其滤 膜和过滤器在使用前应充分干燥为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供 试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液 冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，且总冲洗量不宜过大，以避免滤膜上 的微生物受损伤水溶液供试品：取规定量，直接过滤，或混合至含适量稀释液的无菌容器内， 混匀，立即过滤如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用适量的冲洗液冲洗 滤膜，冲洗次数不得少于三次冲洗后，如用封闭式薄膜过滤器，分别将100m l硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应的滤筒内如采用一般薄膜 过滤器，取出滤膜，将其剪成3等份，分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基 及改良马丁培养基的容器中，其中一份做阳性对照用可溶于水的固体制剂供试品：取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签说明 复溶，然后照水溶液供试品项下的方法操作内酰胺类抗生素供试品：取规定量，按水溶液或固体制剂供试品的处理法 处理，立即过滤，用适宜的冲洗液冲洗滤膜。