脉冲场凝胶电泳.docx

精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档,欢迎阅读下载==============脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis， PFGE)为代表的分子生 物学分型方法日渐受到青睐，其原理为 通过一定的方法，直接或间接反映病原 体变异分化的本质即DNA序列的改变， 从而做到微观变化的宏观显示电泳结 果通常是条带图谱该方法的发展成熟 为监测控制细菌的流行提供了广阔的前 景通过分型可以鉴定比较菌株是否一 致，对于细菌性传染病监测、传染源追 踪、传播途径调查和识别等暴发调查有 着非常重要的意义 一、脉冲场凝 胶电泳的原理 PFGE与常规电泳的 不同之处在于，常规的电泳采用的是单 一的均匀电场，DNA分子经凝胶的分子 筛作用负极移向正极而PFGE采用了 两个交变电场，即两个电场交替地开启 和关闭，使DNA分子的电泳方向随着电================精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档,欢迎阅读下载============== 场的变化而改变正是因为电场方向的 交替改变，才使大分子DNA得以分离。

图1是根据Carle和Olson最初设计的正 交场 电泳装置(orth-ogonal field gel electrophoresis， OFA-GE)绘制的 PFGE 示意图A、B代表两个交替开启和关闭 的电场当A电场开启时，B电场关闭, DNA分子从A电场的负极(A-)向正设 (A+ )移动；当B电场开启时，DNA分子 改变原来的运行方向，随B电场负极向 正极移动 这样，随着电场方向的交替变化DNA分子图1 PGE的原理 (OFAGE系统)A、B代表两电场 即呈 “Z”字形向前移动目前的理论和实验 研究表明，当某一电场开启时，DNA分 子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸 展,以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶 孔如果电场方向改变DNA分子将必 须先调转头来，才能沿着新的电场方向 泳动这样，随着电场方向反复变化， 伸展的DNA分子必须相应地变化移动 方向可以想象，较小的分子能相当快================精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档,欢迎阅读下载============== 速地适应这种变化，但大分子则需更多 的时间来改变方向，而真正用于前移的 时间相对减少，从而将不同大小的分子 分开。

此外还发现，当交替变化的两个 电场方向的夹角大于90°时，DNA能较 迅速地将其后端调转过来，在新的电场 中成为泳动的前端但另一方面，于DNA 分子是顺长度穿越凝胶孔的，当电场方 向突然改变时，分子的两端可能同时伸 入不同的凝胶孔，折为U形或J形结构 而被阻隔下来只有当新的前端移向更 前方时，另一端才能被牵拉下来因DNA 分子具有很大弹性，当某一端挂在凝胶 孔时，DNA分子拉长，滑落下来后又 收缩，并很快赶上前端但当电场强度 太大时，大分子DNA因带有均匀的电 荷，电场力的作用将可能使同一 DNA大 分子的多个部位同时进入多个凝胶孔， 结果被陷住而不再向前移动这就是在 分离人酵母菌(S. pombe)染色体等大分 子时要用低电场的原因 二PFGE 在分子生物学中的应用 PFGE是一================精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档,欢迎阅读下载============== 种非常有效的分子分型方法在国外被 广泛应用于很多菌种的分子流行病学研 究中能够用于分析菌株之间的相关性, 协助追踪感染来源，在疫情控制方面可 发挥重要的作用具体表现在以下几个 方面： 1研究菌株之间的遗传差异。

2在表面上散在分布的病例中 寻找可能的联系，通过监测及时发现暴 发当今传染病暴发流行的性质发生了 改变，即：暴发流行不再局限于某一地 区，一段相对集中的时间里，同一污染 源引起的暴发流行，而是多个传染源.在 较长的时间段内，跨越省市甚至是国家 的暴发流行脉冲场凝胶电泳方法于其 自身优势而被广泛应用于追踪监测细菌 传染性疾病的暴发流行，还有助于识别 散发病例的传染源 3可用于对已 确认的爆发疫情进行传染源的追踪，从 而有效预防疫情的再次发生 4除 了帮助流行病学调查外.细菌分型还能 对病人的诊断和治疗提供线索，对连续 继发性感染患者分离菌株进行PFGE分================精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档,欢迎阅读下载============== 析可以区分是复发(单一菌株型)还是新 的菌株引发的再感染 5 PFGE也 用于抗生素敏感株和多重耐药菌株的分 子分型，如耐苯唑西林的金黄色葡萄球 菌和耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌 (MRSA) 6对生活环境中分离的菌株和病人中分离菌株进行相关性分 析 7 PFGE还可用于其他领域， 如百日咳抗原性变异和PFGE的相关性。

三、脉冲场凝胶电泳的方法 高分子量DNA琼脂糖凝胶块制备和加工 1.收集10ml全血，加入30ml细胞裂解 液置冰浴中至少20min直至红细胞完 全溶解 2. 2000r/min 离心 10min，移去红色上清液，再次用细胞裂解液洗 涤细胞，然后用PBS重悬细胞3.稀释单细胞悬液并取一小份用 Neubauer腔计数细胞 4.用PBS重悬细胞，以达到40“l PB中含1百万 个细胞比例 5.用PBS配制2%浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50°C6. 将等体积细胞悬液与琼脂糖溶液于室 精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，感谢阅读下载 、 L 7================精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档,欢迎阅读下载============== 温下混匀，立即倒入凝胶块模具中7. 静置20min让琼脂糖固化，用无菌塑 料杯将凝胶块自模具中取出并置入蛋白 酶缓冲液中，加入2mg/ml的蛋白酶K8. 将带有凝胶块的蛋白酶K缓冲液于50°C保持2〜3天每个盛有50ml蛋白 酶缓冲液的Falcon管可容纳多达100个 凝胶块 9.蛋白酶K消化后，可将凝胶块保留在此缓冲液或/L EDTA 溶液中保存于4C。

10.此外，继续将凝胶块用高压消毒过的TE缓冲 液冲洗数遍的步骤 11.将凝胶块放入装有 TE及/ml PMSF溶液的 Falcon试管中，灭活残留的蛋白酶K12.室温下用TE溶液漂洗凝胶块数次, 将凝胶块放入另一干净的试管，可直接 用于酶切反应或用/L EDTA，4C保存凝 胶块 13.若用EDTA保存凝胶块，取出后应用TE溶液室温下漂洗30 minx2次 大小标准物的制备1）九多联体 1 .以TE缓冲液悬浮 九多联体，浓度为4昭/40卩1 2.用 精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，感谢阅读下载 ================精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档,欢迎阅读下载============== 等体积TE配制的2%低熔点琼脂糖混 匀 3.移去混合液注入预冷的凝胶 块模具中 4•室温下用TE及100 mmol/L NaC 1 溶液温育 2 天 2)酵母染色体 1 .从YPD培养基瓶 皿中挑选单一一克隆加入10ml YPD预培养的肉汤中，30°C下剧烈震荡 生长24小时，然后加入200ml YPD肉汤， 剧烈振荡24〜48h 2. 4000xg转速，离心10min，然后用50mmo1/L EDTA/10 mmol/L Tris-HC1()溶液悬浮。

3•仍以4000xg转速离心10min,再用 SCE[1 mol/L山梨醇，/L枸椽酸钠，及 10 mmol/L EDTA ()]溶液重悬4.取稀释后的细胞悬液用Neubauer腔 计数 5 .溶液短暂离心后，再用SCE重悬细胞，使40皿SCE溶液中含 5x107个细胞 6•溶液与/ml酵母扣糖酶100T和100mmol/L卩-巯基乙醇 混匀，37C保温15〜30min 7.细胞悬液与等体积的SCE配制的2%低熔 点琼脂糖凝胶混匀，保持在50C 精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，感谢阅读下载 ~ 7 ~================精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档,欢迎阅读下载==============8 .将混合物移注入预冷的凝胶块模具 中 9 .凝胶块用含10 mmol/L二硫苏糖醇的SCE溶液37°C下振荡温育1〜 2小时 10.将凝胶块移入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml蛋白酶K, 50C 温育 48h 11. 用 50 mmol/LEDTA/10 mmol/L Tris-HCl()溶液洗涤凝 胶块3次，每次20min 12.凝胶块可用此混合液于4C保存或不用漂 洗直接装载入凝胶中。

琼脂糖凝胶块中DNA的限制性内切酶消化 1.应使用消毒溶液及戴无菌手套以免 DNA 降解 2 .在Falcon试管中用lxTE溶液漂洗凝胶块20min 3次，以去 除EDTA 3 .混合：酶反应缓冲液,100 mmol/L亚精胺，10〜20单位的内切 酶20单位的内切酶就足以过夜完全消 化10“g DNA 4.设立一个除内切酶成分外含有混合物各组分的阴性对 照，以检查是否有非特异性DNA降解5 •将琼脂糖凝胶块加入反应混合溶液 中：通常用消毒过的手术刀或套环将凝================精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档,欢迎阅读下载============== 胶块移入 6 .若两种内切酶所需缓冲液条件一致，可以同时或先后用 两种不同的酶进行消化倘若首次消化 的酶要求50°C条件，在第二个酶消化时 要换缓冲液 7.若要进行部分消化，则首先在同一温度和反应时间用1： 10稀释的酶进行尝试凝胶电泳 1.将％的琼脂糖在xTBE中熔化后冷却 至50〜60C，立即注入凝胶框架中，并 插入梳子 2 .凝胶固化后小心地拔出齿梳，用2把无菌手术刀将DNA凝胶 块上样若用不同内切酶消化凝胶块， 则取不同样品时应将手术刀片烧灼后冷 却。

将DNA大小标志物上样至凝胶的两 旁 3.用1 %液态低熔点琼脂糖凝胶密封狭槽 4.若有气泡存在，用注射器驱赶气泡 5.一旦密封的低熔点琼脂糖已固化，可将凝胶搁 入腔室，并用电泳缓冲液覆盖过胶面6. 应设定合适的电压及转换时间并开始 电泳两个不同电泳方向的电流应相等7. 电泳结束后，凝胶用xTBE配制成的================精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档,欢迎阅读下载==============EB染色8.用泵自槽中排除缓冲液, 续以双蒸水冲洗电泳槽 9.凝胶成像：DNA在曝光的过程中可能会形 成缺口 10.用/L HC1漂洗凝胶30min,让DNA脱嘌吟，并有利于转移 11.凝胶用碱变性20min，两次，续以中 性溶液1〜5min 12 .采用标准Southern印迹方案将DNA转印至尼龙膜 上一般来说，印迹PFGE凝胶的时间 较普通凝胶印迹时间长 四、脉冲场 凝胶电泳的分类 1. InCert琼脂糖 ----兆碱基片断DNA制备获准使用的琼 脂糖 是一种极为有用的制备脉冲场凝胶电泳用染色体DNA样品的低 胶凝温度琼脂糖研究证实InCert琼脂 糖凝胶可支持凝胶中染色体DNA的制 备和限制性核酸内切酶消化。

应 用：脉冲场凝胶电泳分析说明：胶凝温度：26°C-30°C 硫酸盐：<%凝胶强度(%)： >400g/cm 2 熔化温 度：<70 C 湿度。