2021石蜡切片的制作过程.docx

石蜡切片的制作过程石蜡切片的制作过程（一）花药切片制片法1．取材2．固定：FAA液中固定24h，并保存在其中3．脱水：经70％乙醇、85%乙醇，每级3~4h，含1%伊红的95％乙醇中3~4h（可以过夜），无水乙醇2次，每次1~2h4．透明、加蜡：5级氯仿透明，每级3~4h，纯氯仿2次，每次2h，加碎蜡，然后置36℃温箱中1~2d5．浸渗、包埋：50%、70%蜡各3h，再经纯蜡A、纯蜡B、纯蜡C三杯，每杯1h，包埋6．修蜡块、切片：粘蜡块时组织块直立于台木上，并用单面刀片切除先端石蜡，浸水软化后放在切片机上坐横切片，切片厚12μm7．展片、粘片、烘片：蜡片先镜检，每张载玻片上放2个蜡片，展片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃温箱中烘干8．脱蜡、透明：二甲苯脱蜡、透明各1次9．染色（番红-固绿双重染色）：在已脱蜡的材料上滴注无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、蒸馏水各4~5s，苯胺番红染色5~10min，用蒸馏水洗去浮色10．脱水、透明：各级乙醇脱水（30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇），苯胺固绿复染30~40s，再经95%乙醇，无水乙醇，1/2无水乙醇+1/2二甲苯、二甲苯2次，各约4~5s，最后置二甲苯缸中。

11．封片、烘片：加拿大树胶封片封片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃左右的温箱内烤数天即可烤干最后，将干燥好的切片上的浮色擦净，并在玻片的左端粘上标签，注明组织切片的名称、染色方法、固定方法、年月日制片日程（二）花芽纵切片制片法1．取材2．固定：FAA液中固定24h，并保存在其中3．整染：经70％乙醇、50%乙醇各2~4h，转入爱氏苏木精稀释液（爱氏苏木精原液1份，加入50%乙醇及乙醇各半的混合液1份）中整染2~3d4．水洗、反蓝：蒸馏水浸洗，勤换水至无浮色渗出，再转入自来水中，换1~2次水，至样品由紫色变深蓝色为止，共需时约1d5．脱水及复染：经30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇，每级3~4h含0.5%~1%伊红的95％乙醇中4~6h（可以过夜），无水乙醇2次，每次2h6．透明、加蜡：5级氯仿透明，每级2~4h，纯氯仿2次，每次2h，加碎蜡，然后置36℃温箱中1d7．浸渗、包埋：50%、70%蜡各3h，再经纯蜡A、纯蜡B、纯蜡C三杯，每杯1h，包埋8．修蜡块、切片：纵切花芽，切片厚8μm9．展片、粘片、烘片：蜡片先镜检，每张载玻片上放2个蜡片，展片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃温箱中烘干。

10．脱蜡、透明：二甲苯脱蜡、透明各1次11．封片、烘片：加拿大树胶封片封片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃左右的温箱内烤数天即可烤干制片日程（三）子房纵切片制片法1．取材2．固定：纳瓦申固定液中固定24h3．保存：经30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇，每级30min，并保存于70%乙醇中备用4．脱水：经85%乙醇，含0.5%~1%伊红的95％乙醇中3~4h，无水乙醇2次，每次2h5．透明、加蜡：5级氯仿透明，每级3~4h，纯氯仿2次，每次2h，加碎蜡，然后置36℃温箱中1~2d6．浸渗、包埋：50%、70%蜡各3h，再经纯蜡A、纯蜡B、纯蜡C三杯，每杯1h，包埋时子房横卧，使扁平面与纸盒底部平贴7．修蜡块、切片：沿子房扁平面纵切，切片厚12μm镜检，只保留切到胚囊的蜡片，其余淘汰8．展片、粘片、烘片：蜡片先镜检，每张载玻片上放2个蜡片，展片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃温箱中烘干9．脱蜡、透明：二甲苯脱蜡、透明各1次10．复水：1/2无水乙醇+1/2二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、蒸馏水11．媒染：4%铁矾10min铁矾即绿矾，硫酸亚铁。

12．水洗：自来水流水洗10min13．染色：0.5%苏木精10min14．水洗：自来水流水洗5min15．分色：2%铁矾分色至适度（镜检确定）16．水洗、反蓝：自来水流水洗10~15min至反蓝17．脱水、透明：滴注蒸馏水、各级乙醇脱水（30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、），含1%伊红的95％乙醇中复染，再经无水乙醇，1/2无水乙醇+1/2二甲苯、二甲苯滴注后，置二甲苯缸中18．封片、烘片：加拿大树胶封片封片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃左右的温箱内烤数天即可烤干超薄切片法（一）以Epon 812为包埋介质的植物组织制样流程1 取材：常温取样，低温保存（0~4℃）2 固定和浸洗：1%~3%戊二醛固定液固定2h，最多不超过1周PBS缓冲液20~30min(更换1~3次)，然后1%~2%OsO4固定液固定1~2h，PBS缓冲液20~30min(更换1~3次)3 脱水：30%丙酮水溶液，50%丙酮水溶液，70%丙酮水溶液（或冰箱过夜）10~20min，在常温条件下，90%丙酮水溶液，100%丙酮水溶液，“纯丙酮”（更换2次）每次10~20min4 渗透：Epon 812混合液：纯丙酮（1:3）12h，Epon 812混合液：纯丙酮（1:1）12h，Epon 812混合液：纯丙酮（3:1）12h，Epon 812混合液（35~40℃）12h。

5 包埋和聚合：将组织放入胶囊（或包埋板）中，加入新鲜的Epon 812混合液，放烘箱中加热35℃12h ，45℃12h ，60℃24h ，树脂聚合后，待冷却到室温，进行切片6 制刀：用制刀机制出刀刃锋利的玻璃刀若用钻石刀则省略此步7 修块：经粗修，将包埋块修整合适8 切片：在切片机上固定好包埋块和切片刀，调整刀位后对刀、进刀，完成细修后切片，厚度60~80μm，铜网捞片，风干或灯下烤干9 染色：常规铅-铀染色把一张滤纸平铺在有盖平皿底部用配制染剂的溶液将其润湿，上放一小片干净牙科蜡将染液滴于蜡块上，迅速盖上平皿盖将欲染载网浮在液滴上，注意切片朝下一般采用铀-铅双染法：先用1～3％醋酸双氧铀水溶液或70％酒精溶液将载网按上述方法染20～30min染后必须清洗，一般用钟表镊子夹载网浸入清洗液中，反复清洗，清洗液可放在试管中或小瓶中经三瓶清洗液即可注意将镊子中间夹缝液体用一小片滤纸将其吸干用硝酸铅与柠檬酸钠配制成柠檬酸铅，将其溶于氢氧化钠，可得到稳定的强碱溶液（pH12）染、洗方法同前用铅染时，可用0.1MNaOH浸湿滤纸，以吸收空气中CO2，防止生成碳酸铅沉淀污染切片或将NaOH放在牙科蜡周围。

配制染液用的蒸馏水应煮沸10min以驱除CO2，染毕，用0.02NNaOH(准确称取取0.8g的氢氧化钠，溶于500ml蒸馏水中，再移入到1000ml容量瓶中，定容至刻度)和无CO2蒸馏水连续冲洗以除去载网上多余染液，载网清洗后置于培养皿的滤纸上干燥10 镜检：将染色后的切片放入干燥器中干燥后，在透射电镜下观察实验结果二）整体样品表面结构观察的制样方法1 取材：取样要准确，体积不宜过大，以减少不必要的观察量取样时动作要轻巧，防止挤压损伤样品2 固定：一般采用双固定法，即先用1%~3%的戊二醛/缓冲液在室温或4℃下固定一般单细胞可固定10~30min，较大的样品固定1~2h，甚至更长，再用1%OsO4/缓冲液在4℃下固定30~60min3 清洗：对于表面凹凸不平，且粘有很多杂质的样品，在固定前后都要进行彻底的清洗，以免影响成像的质量一般采用缓冲液冲洗法：缓冲液在4℃下彻底冲洗3次，每次15min4 脱水和置换：用系类乙醇或丙酮逐级脱水一般30%，50%，70%，80%，90%，100%，每步15~20min用乙酸异戊酯置换100%的乙醇，在室温下，置换20min以上5 干燥：CO2临界点干燥(1 置换：把已经固定好，并脱水到100%乙醇的样品浸入乙酸异戊酯中20min以上，室温或4℃。

2 仪器准备：打开总电源，先向HCP-2中注入少量液体CO2，再用放气阀排出，以检排放是否通畅同时对样品室预降温，以低于室温10℃为宜3 准备样品：把样品笼的底和盖都垫好干净的滤纸，并滴上乙酸异戊酯，将样品面朝上放入，扣牢样品笼盖将样品笼放入样品室，用旋转棒旋紧样品室盖4 注入液体CO2：打开进气阀，控制流量，使液体CO2缓缓进入样品室通过观察窗判断液面，以液面充盈样品，略高出样品笼高度为宜压力表指示60~70kg/cm2注入完毕时，将进气阀关闭5 调温：调节控温钮至20℃，保持15~20min，使液体CO2充分置换乙酸异戊酯然后再调节至35~4 0℃，使压力维持在73kg/cm2以上，不要超过110kg/cm2，稳定后维持5~10min6 排气：在维持原温度的条件下，轻轻打开慢排气控制钮，控制排气量，以计量管中的小球悬浮在中间微微地上下跳动为宜，或使排气管在水中吐出的气泡既连续不断又可数清为宜7 取出样品：气压降至零后，将温度调至略高于当时室温，打开盖，取出样品，迅速放入玻璃干燥器中6 粘样：将干燥好的样品用导电胶或双面透明胶纸粘在样品台上，做好标记7 喷涂：喷涂要在真空条件下进行，有专门的仪器，一般喷涂10~20μm厚的金或铝，使样品有良好的导电性，能顺利释放二次电子。

离子溅射镀膜法:1 样品准备：将样品充分干燥2 样品放置：样品放在靶电极的正下方，间隔2.5~3cm样品个数不限，但总面积不能超过靶面积的30%，并盖好真空罩3 抽真空：达0.01托（1Torr=1 mm Hg=133 Pa）4 加高压：先定时2min，再打开高压开关，并调节放电电压（1200~1400V），此时电流应达5mA以上5 镀膜：先确认电流指示已达到2mA以下，再慢慢打开针状阀门，将电流指示调到7~9mA，并保持30s接着再微微关闭针状阀门，将电流调到5~6mA，镀膜，直到所定时间结束，镀膜完毕真空喷镀镀膜法：1 把样品放在样品台上，盖好钟罩，抽真空至10-6~10-5托2 慢慢带来加热器，使金-鈀合金丝缓慢融化并蒸发3 打开样品台的倾斜装的速度旋转约1min，完成喷镀一般膜厚3~30nm4 关闭加热器，停留若干分钟，使样品镀膜稳定，再缓缓向钟罩中放入空气，直至恢复到标准大气压后，再取出样品常用固定液的配制1. 福尔马林-醋酸-酒精固定液(FAA)50%或70%酒精90ml + 冰醋酸5ml + 福尔马林(37%~40%甲醛)5ml可用作固定植物的一般组织,但不适用于单细胞及丝状藻类,也不适宜作细胞学研究。

幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，可防止材料收缩若材料坚硬，可略减冰醋酸，略增福尔马林若材料易收缩，可稍增加冰醋酸久置时另加入5ml甘油以防蒸发和材料变硬此液又可作保存液固定时间最多10h如果用在植物胚胎的材料上，改用下面的配方，效果较好：50%酒精89ml + 冰醋酸6ml + 福尔马林5ml2. 福尔马林-丙酸-酒精固定液（FPA）福尔马林5ml + 丙酸5ml + 70%酒精90ml固定一般的植物组织，通常固定8~24h，可长久保存3. 酒精-醋酸-氯仿固定液（卡诺固定液，Carnoy fixative）配方Ⅰ：纯酒精3份+ 乙酸1份配方Ⅱ：纯酒精6份+乙酸1份+ 氯仿3份配方Ⅲ：甲醇6份+乙酸1份+ 氯仿3份4. 7. 铬酸-醋酸-福尔马林混合液这3种药品混合在一起所配成的各种固定液，通常称纳瓦申固定液（Nawashin fixative），简称Craf配方见下表：甲、乙两液均为贮备液，使用之前才将二者混合适用于组织学和细胞学的研究材料柔嫩而含水多的材料，可选用Ⅰ或Ⅱ固定，坚韧而成熟的材料，可用高浓度的Ⅳ或Ⅴ，一。