有机磷水解酶基因多拷贝表达载体的构建.docx

有机磷水解酶基因多拷贝表达载体的构建及其在酵母中的表达13 试点班 2013221107110058 卓琴 摘要：目的：构建 OPH2 的多拷贝表达载体，筛选获得高表达的菌株，并对表达的产物进 行初步的酶学性质研究方法：利用 overlapping 方法合成 OPH2 基因，用生物砖的方法构 建多拷贝， 将构建完成的基因连接到 pHBM905BDM 表达载体上,将该载体通过化学转化 法转入毕赤酵母工程菌中，摇瓶发酵，筛选表达菌株，并对表达产物进行鉴定和酶学性质研 究结果：成功构建了 OPH2毕赤酵母表达载体，并获得OPH2的多拷贝表达菌株，通过鉴 定获得目的表达产物结论：通过毕赤酵母表达系统，成功构建了高表达、高活性的OPH2 重组菌株，使得0PH2工业化生产和应用有着良好的前景关键词：载体构建；基因表达；毕赤酵母；多拷贝Construction of Recombinant Plasmid with Multi-copyExpression Cassette for High Expression oforganophosphorushydrolase in Pichia pastorisAbstract: Objective: To construct recombinant plasmid with multi-copy expression cassette of OPH2 and to obtain strain with high expression. Research on the characterization of expression product. Methods: The Gene of OPH2 was synthesised by over lapping and muti-copy was constructed by bio-brick. The recombinant plasmid was transform in Pichia pastoris .The clones were picked up and screened in shaking culture. Results: The vector pHBM905BDM-oph2 was constructed and high expression strain was screened. Conclusion: By pichia expression system, successfully built a high expression, highly active OPH2 recombinant strains, makes OPH2 industrialized production and application has a good prospect.Key words: Recombinant Plasmid; Pichia pastoris; Protein Expression;multi-copy0 引言 有机磷农药具有高效、杀虫广泛等特点,对农业发展和人类粮食供给做出了巨大的贡献。

但 有机磷具有较强的毒性,大量使用后造成日益严重的环境与健康问题目前我国农药杀虫剂 占农药总产量的 70%；在杀虫剂中,有机磷杀虫剂占 70%；在有机磷杀虫剂中，高毒品种占 70%［1］由于有机磷农药大量不合理的使用，使得蔬菜、粮食、瓜果等农产品甚至土壤中的 有机磷农药残留严重超标有机磷通常含有三个磷酯键，所以常被称为磷酸三酯有机磷降 解酶(organophosphorushydrolase, OPH)是一种磷酸三酯酶，可以将有机磷农药分子在磷酯 键处断裂［2］，使有机磷农药分解为环境可以接受的低毒或无毒小分子物质，从而达到降低毒 性的目的1 方法和材料1.1 实验方法1.1.1 载体和菌株用于克隆及转化的 Escherichia coli XL10-Gold 和用于表达的 Pichia pastoris GS115 为 本实验室保存载体 pHBM905BDM 为本实验室构建1.1.2 主要实验试剂4 种 dNTP、DNA 分子量标准 hEcoT14 digest、dATP、dTTP、dGTP、dCTP 均购 自 TaKaRa 公司；限制性核酸内切酶 Xba I、BamH I、Not I、Cpo I、Spe I、EcoR I、 Soultion I连接酶、KOD plus DNA聚合酶、T4 DNA 聚合酶均购于TaKaRa公司。

1.2 方法1.2.1 Oph2 基因密码子优化及基因合成根据 GeneBank 中登陆的 oph2 基因序列，按照酵母密码子偏爱性对该序列进行优 化，设计好引物送至上海生物工程公司合成，在基因合成中 oph2 基因片段 3'端加上 EcoR I 和 Xba I，在 5'端加上 Spe I 和 BamH I1.2.2 pHBM905BDM-oph2 表达载体的构建对载体pHBM905BDM进行EcoR I和Spe I双酶切⑶,用连接酶进行连接处理后， 转化到大肠杆菌感受态细胞中，培养过夜后随机挑选菌落进行菌落PCR,对阳性结果的菌 落抽提质粒并送至测序公司测序，验证是否为成功构建完成1.2.3 pHBM905BDM-oph2在毕赤酵母中表达用电转化法将构建好的oph2表达基因转入毕赤酵母GS115菌株中，摇瓶发酵，甲 醇诱 60 导［4］，跑 SDS-PAGE 凝胶电泳，检测表达情况，筛选出表达菌株1.2.4 酶活性的测定根据文献报道的酶活测定方法,在试管中加入5gL甲基对硫磷溶液(10mg/mL), 900yL 50mmol/L Tris-Hcl缓冲液和lOOyL酶液，37°C保温10min,然后加入1mL 10%三氯乙酸终 止反应，混匀后再加入1mL10%Na 2 CO 3显色，取其上清在410nm处测定光吸收值，据 此方 法计算酶活［5］。

1.2.5 表达情况分析将筛选得到的高表达酵母菌株利用YPD培养基进行活化,接入到BMGY培养基中， 以扩大生物量，培养48h后转入BMMY中培养6天，每天定时加入50吐甲醇，诱导酵母 进行表达每隔24h取样，跑SDS-PAGE电泳，比较每天的表达情况，并用Brandford方 法测 定表达量［6］2 结果2.1 基因合成情况将引物和 KOD plus DNA 聚合酶混合， PCR 仪设置反应程序，反应完成后经琼脂糖 凝胶电泳分析，PCR扩增获得的OPH2基因条带大小为906bp，与预期一致，见图1M S20001000750兀0250100泳道 M 为 DNA marker(DL-2000),条带大小为 2000, 1000, 750, 500, 250,及 100；泳 道S为合成的OPH2基因，条带大小为906bp图 1 OPH2 基因的 PCR 检测结果2.2 多拷贝表达质粒的鉴定通过生物砖的方法构建多拷贝并连接到 pHBM905BDM 载体，将构建的各种拷贝数的质粒分别经琼脂糖凝胶电泳分析，获得的条带大小与预期一致,见图 2，证明质粒构建正确2 3lm:川7 7 4?；£223547226901S3214 J'.i泳道 M 为 DNA marker（久-T14）,条带大小为 19329, 743, 6223, 4254, 3472, 2690, 1882, 1489, 925, 421及74 bp；第1到4泳道分别为oph2的1到4拷贝重组质粒。

图 2 多拷贝重组质粒的鉴定2.3 Oph2 的表达和鉴定50ml摇瓶发酵用发酵液上清跑SDS-PAGE比较每天表达情况，见图3根据实验结果可得, 摇瓶发酵条件下,随着诱导时间的增加,毕赤酵母的表达量在增加泳道M为标准蛋白质预染marker；第一泳道为不含OPH2基因的酵母发酵上清第2到7泳道为诱导48, 72, 108, 120, 144h发酵液上清，上样量为20“L图 3 SDS-PAGE 电泳分析 OPH2 诱导表达情况2.5 酶学性质的探究根据文献中酶活的测定方法，探oph2的最适反应条件对重组酶的几个特性进行测定 最适温度20°C至I」80°C的范围内进行测定，最适pH在5-12范围内进行测定温度对酶活性 的影响如图 4 所示, pH 对酶活性的影响如图 5 所示综合实验结果分析,有机磷水解酶 oph2在较宽的温度范围内保持较高的活性，在50C附近有最大活性,80摄氏度完全失活； oph2在较宽的pH范围内保持较高的活性，在pH为11的时候活性最高pH图 5 pH 对酶活性的影响3 讨论 毕赤酵母表达系统具有表达量高、成本低廉等特点，本实验中构建了多拷贝表达质粒， 为获取高产量表达工程菌奠定了良好的基础。

在重组蛋白表达领域， 工程菌含有的表达质 粒拷贝数和表达量不一定成比例关系，在一些情况下，拷贝数的增加与表达量的关系并不明 显，甚至有的会影响菌体生长，使表达量降低 [6]本实验中 1-3 拷贝表达量在上升，4 拷贝时表达量下降，印证了上述观点发酵的表达量达到0.55 mg/mL，比活达到14U/mg, 在酶特性的研究中发现该重组酶最适温度范围较广，耐碱在今后的研究中，通过优化发酵 条件等途径，有望进一步提高oph2的表达量，需要扩大反应发酵体积，研究金属离子等对 酶活性的影响，为oph2的工业化应用奠定基础[ 参考文献][1] 胥维昌.我国农药废水处理现状及展望[J].化工进展,2000,(05).[2] 伍宁丰,邓敏捷,史秀云,等.一种新的有机磷降解酶的分离纯化及其酶学性质的研究.科学通 报,2003,43(4):453 〜459[3] J. R. Kelly,A. J. Rubin,J. H. Davis,C. M. Ajo-Franklin,J. Cumbers,M. J. Czar,K. d. Mora,A. L. Glieberman,D.D. Monie,D. Endy.Measuring the activity of BioBrick promoters using an in vivo reference standard. J. Biol. Eng .2009[4] Leonardo M. Damasceno,Chung-Jr Huang,Carl A. Batt. Protein secretion in Pichia pastoris and advances in protein production[J]. Applied Microbiology and Biotechnology . 2012 (1)[5] Mulbry W W,Karns J.Purification and characterization of three parathion hydrolases from gram-negative bacterial strains. Applied and Environmental Microbiology . 1989[6] Bradford, M. M. 1976. A rapid sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-252.。