电针水沟对脑出血大鼠大脑皮质 NPY 调节作用的动.doc

精品论文推荐电针水沟对脑出血大鼠大脑皮质 NPY 调节作用的动态观察1孙国杰，杜艳军，孔立红 湖北中医学院针骨系，武汉（430061） E-mail：sunguojie@摘 要：目的：观察 NPY 在大脑皮层神经细胞和内皮细胞中的表达，探讨电针水沟对脑出 血大鼠 NPY 调节作用的动态变化方法：将健康青年 Wistar 大鼠随机分为正常组、假手术 组、模型 3h、24h、72h 组、电针 3h、24h、72h 组，每组各 10 只采用胶原酶Ⅶ诱发的大 鼠尾壳核出血模型；电针组在诱导大鼠尾壳核出血模型的基础上，用 26 号、1 寸不锈钢毫 针电针“水沟”，接 G6805－II 电针治疗仪（空白电极接大鼠耳朵），连续波，频率 120 次⁄min， 强度 1mA，留针 30min造模麻醉醒后立即针刺 1 次，每隔 24h 再针刺一次，3 天后取材 根据 Bederson 神经体征评分法进行综合等级评分，并采用免疫组化方法检测 NPY 在大脑皮 层神经元和内皮细胞表达结果：（1）造模麻醉醒后模型组与电针治疗组的神经缺损体征 综合评分无明显差异（P＞0.05），且电针治疗组的神经缺损体征略高于模型组。

电针治疗组 经电针治疗后，其神经缺损体征综合评分逐时递减，与模型组比较有明显差异(p<0.05 或 p<0.01),与电针治疗前比较亦有明显差异(p<0.01)2）正常组与假手术组大鼠大脑皮层神经元和内皮细胞有少量的 NPY 阳性表达；脑出血后 3h 大鼠大脑皮层 NPY 的阳性表达开始增高，24h 呈最高峰，胞浆和突起浓染呈棕褐色，血管内皮细胞细胞质中有棕色颗粒，72h 时 有所下降，与正常组比较均有显著性差异（P<0.01）电针组大鼠大脑皮层神经元和内皮细 胞的 NPY 阳性表达，也于 3h 开始表达，于 24h 表达较高，72h 表达减弱，与模型组比较均 有显著性差异（P<0.01），与正常组比较 P<0.05结论：电针水沟穴能有效抑制脑出血后 3h、24h、72h 时大脑皮质神经元和血管内皮细胞 NPY 的表达增强，改善脑出血大鼠的行为体征 但提示脑出血后不同时间段 NPY 对血管内皮细胞的作用效应机制可能是今后脑出血防治研 究的新问题关键词：神经肽 Y，脑出血，针刺疗法，水沟近年来，越来越多的临床资料表明血肿扩大及其继发性脑损害才是导致病情加重甚至 死亡的主要原因，脑血管的舒缩功能则直接影响脑出血后血液的循环与调节。

目前关于神经 肽 Y(NPY)在脑血管内皮细胞的作用研究较少，本实验将采用免疫组化方法，观察 NPY 在 大脑皮层神经细胞和内皮细胞中的表达，初步探讨电针水沟对脑出血大鼠脑血管神经调节的 动态影响1 材料与方法1.1 动物与试剂健康青年 Wistar 大鼠（湖北省医学科学研究院实验动物中心提供）80 只，体重 200～250g，雌雄各半查随机数字表，分为正常组（10 只）、生理盐水组（10 只）、模型组（30只）、电针治疗组（30 只）再依同样的方法将模型组、电针治疗组分别分为 3h、24h、72h，3 小组，每组 10 只SABC 试剂盒和兔抗大鼠 NPY 单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有 限公司1.2 动物模型制作采用胶原酶Ⅶ诱发的大鼠尾壳核出血模型[1]动物经 6%水合氯醛腹腔麻醉（400mg/kg），1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（20040507004）的资助 3 -头顶备皮后将动物固定于脑立体定位仪（WDT-Ⅱ微电极推进器脑立体定位仪，国营西北光学仪器厂）上，正中矢状切开头皮，剥离骨膜，调节门齿托的高度，使动物的前、后囟处于 同一水平以前囟为坐标原点，向后 1.0mm，向右 4.0mm，确定注射点坐标，用手动微型 钻（直径 1.0mm）在注射点钻透颅骨。

用 1ul 的微量注射器吸取 0.8ul 的胶原酶溶液（Sigma， type Ⅶ，0.5unit/ul），缓慢进针 5.0mm，缓慢注射后留针 2min，缓慢退针，钻孔处填入明胶 海绵止血缝合皮肤，腹腔注射氨苄青霉素 8 万单位，动物清醒后放回笼内饲养1.3 治疗方法在诱导大鼠尾壳核出血模型的基础上，用 26 号、1 寸不锈钢毫针电针“水沟”，接 G6805－II 电针治疗仪（空白电极接大鼠耳朵），连续波，频率 120 次⁄min，强度 1mA，留针 30min 造模麻醉醒后立即针刺 1 次（麻醉手术后约 40min 苏醒），每隔 24h 再针刺一次，3 天后取 材1.4 检测方法1.4.1 根据 Bederson 神经体征评分法进行综合等级评分0 级：无任何行为异常，无缺 损体征；1 级：左前肢屈曲；2 级：无旋转运动，但对来自右侧推力的抵抗力减弱；3 级： 对来自右侧推力的抵抗力减弱的同时，出现向左侧的旋转运动1.4.2 每组大鼠均用 6％水合氯醛腹腔注射麻醉，开胸经升主动脉依次灌入生理盐水100ml、4℃预冷的含 4％多聚甲醛的 0.01mol/L 磷酸缓冲液（PBS,pH7.4）400ml。

灌毕取脑， 取视交叉至乳头体之间长约 5mm 的脑组织，置于 4％多聚甲醛溶液过夜后固定，石蜡包埋 切片，片厚 5µm按免疫组化 SABC 法常规步骤操作每只动物随机选取 2 张非连续切片， 每张切片在出血侧大脑皮层随机采集 5 个视野光镜下检测以胞浆染成棕色为阳性结果，用 计算机图像分析仪（HPIAS-1000,华中科技大学同济医学院千屏影像公司产），①对各组 NPY 阳性神经元进行光密度分析②计数 NPY 阳性血管内皮细胞总数（镜下血管内皮细胞细胞 浆中有棕色颗粒者为阳性）和阴性细胞数，并计算阳性细胞百分率1.5 统计学处理结果用均数±标准差（ X ± S ）表示，显著性检验用 F 检验，组间比较用 q 检验所有 数据均输入计算机，运用 SPSS10.0 统计软件2 结果2.1 电针对尾壳核出血大鼠神经缺损行为体征的治疗作用模型组：共 30 只1）造模后 3h 出现 2 级体征 3 只，占 10%；出现 3 级体征 27 只， 占 90%，综合等级评分为 2.90±0.03（2）造模后 24h 出现 2 级体征 7 只，占 23.3%；出现 3 级体征 23 只，占 76.7%，综合等级评分为 2.77±0.04。

3）造模后 72h 出现 2 级体征 9 只， 占 30%，出现 3 级体征 21 只，占 70%，综合等级评分为 2.70±0.06电针治疗组：共 30 只1）造模麻醉醒后出现 2 级体征 2 只，占 6.7%，出现 3 级体征28 只，占 93.3%，综合等级评分为 2.93±0.022）造模后经电针治疗 3h 出现 1 级体征 2 只， 占 6.7%，出现 2 级体征 9 只，占 30%，出现 3 级体征 19 只，占 63.3%，综合等级评分为 2.57±0.073）造模后经电针治疗 24h 出现 0 级体征 2 只，占 6.7%；出现 1 级体征 9 只，占 30%；出现 2 级体征 16 只，占 53.3%；出现 3 级体征 3 只,占 10%，综合等级评分为 1.67±0.094）造模后经电针治疗 72h 出现 0 级体征 8 只，占 26.7%；出现 1 级体征 14 只，占 46.7%；出 现 2 级体征 7 只，占 23.3%；出现 3 级体征 1 只，占 3.3%，综合等级评分为 1.03±0.03组别（n） 模型组（n=30） 电针组（n=30）表 1 各组神经缺损体征评分（X±SE）table 1 the grade of nerve missing sign in each group造模醒后 3h 24h 72h2.90±0.03 2.90±0.03 2.77±0.04 2.70±0.062.93±0.02◇ 2.57±0.07◆ 1.67±0.09※ 1.03±0.03※★与模型组比较 ※ P＜0.01 ◆ P＜0.05 ◇ P＞0.05与治疗前比较 ★ P＜0.0132.521.51模型组 电针组0.50造模醒后 3h 24h 72h图 1 模型组、电针治疗组不同时期神经缺损体征综合评分fig1 the grade of nerve missing sign in each group表 1、图 1 显示，造模麻醉醒后模型组与电针治疗组的神经缺损体征综合评分无明显 差异（P＞0.05），且电针治疗组的神经缺损体征略高于模型组。

电针治疗组经电针治疗后， 其神经缺损体征综合评分逐时递减，与模型组比较有明显差异(p<0.05 或 p<0.01),与电针治疗 前比较亦有明显差异(p<0.01)2.2 各组大鼠大脑皮质 NPY 免疫阳性细胞的表达（见表 2-3，图 2）表 2 各组大鼠大脑皮质 NPY 阳性反应的平均光密度值table 2 the OD value of NPY neurons on cortex in each group组别（group）例数(number)3h24h72h正常组100.1135±0.0413――――――(natureal group)假手术组100.1066±0.0314――――――(control group)模型组100.2603±0.0367▲0.3901±0.0634▲0.2094±0.0442▲(model group)电针组100.1708±0.0412▲★0.1680±0.0421▲★0.1649±0.0535▲★(EA group)与正常组比较 ▲P<0.01 △P<0.05 与模型组比较 ★P<0.01表 3 各组大鼠大脑皮质血管内皮细胞 NPY 阳性细胞率(%)table 3 the positive rate of NPY’s expression in endotheliam of cerebral blood vessels组别（group）例数(number)3h24h72h正常组1011.24±1.18――――――(natureal group)假手术组1012.86±1.06――――――(control group)模型组1021.19±3.11▲33.65±4.27▲19.41±2.38▲(model group)电针组1014. 97±2.23△★15.44±2.23△★14. 69±2.42 △★(EA group)与正常组比较 ▲P<0.01 △P<0.05 与模型组比较 ★P<0.01正常组 假手术组模型 3h 组电针 3h 组。