全氟化合物的量子点荧光生物检测方法研究.pdf

华中科技大学 硕士学位论文 全氟化合物的量子点荧光生物检测方法研究 姓名：张炯 申请学位级别：硕士 专业：卫生检验与检疫 指导教师：舒柏华;徐顺清 2011-01 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 全氟化合物的量子点荧光生物检测方法研究 全氟化合物的量子点荧光生物检测方法研究 研究生：张 炯 导 师：舒柏华 教授 中中 文文 摘摘 要要 目的目的：本研究根据全氟化合物中的全副辛烷磺酸基化合物 （PFOS） 、 全氟辛酸 （PFOA） 与过氧化物酶增值激活受体（PPARα）特异性结合的特性和新型荧光标记物量子点 （QDs）建立一种全新的针对环境水体中 PFCs 的快速、高通量的分子生物学荧光检测 方法 方法方法：制备 PFOS-BSA 复合体并将其包被在酶标板上，加入各浓度组标准品 PFOS 与 固定的 PFOS 竞争激活 PPARα， 之后将 PPARα-PFOS 复合体转移至包被 PPARα 特异性 抗体的酶标板中进行固定将 Biotin 标记的 DNA 探针加入到酶标板中，再用 QDs 作 为荧光标记物，通过亲和素-生物素系统标记在 PPRE 的 DNA 双链上，构成特异性量 子点荧光探针，最后通过检测结合在 PFOS 激活的 PPARα 受体上的荧光探针的信号强 度来定量检测 PFOS，之后根据荧光强度和对应实验组的 PFOS 浓度绘制标准曲线，利 用该方法同样对 PFOA 进行检测。

按照国家标准采集环境水样并进行预处理，分别用 上述方法和高效液相色谱质谱联用（HPLC/MS）方法进行检测，根据检测结果和标准 曲线计算得出环境水样中 PFCs 的浓度 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 结果结果：利用 QDs 荧光生物检测方法通过测量不同浓度的 PFOS、PFOA 标准品，检测 QDs 信号的变化并绘制出标准曲线（PFOS: y = 19.112x-23.995, R2 = 0.9642; PFOA: y = 17.601x-20.914, R2 = 0.973） ， 结果显示该方法在浓度为 2.5 ng/L—75 ng/L 范围内线性最 优并具有良好的重复性，最低检测限为 2.5 ng/L，加标回收率分别为 107.8 %和 110.3% 根据不同浓度的标准品检测结果的峰面积绘制标准曲线 （PFOS: y = 2E-05x-26.479, R2 = 0.996; PFOA: y = 2E-05x-25.023, R2 = 0.997） ， 结果显示该方法浓度 2.5 ng/L—75 ng/L 范 围内具有良好的重复性，最低检测限为 1 ng/L, 加标回收率分别为 104.3 %和 105.9 %。

分别用两种方法对长江（武汉段） 、汉江（武汉段） 、东湖、武汉市某水厂以及某品牌 桶装饮用水水样中 PFCs 浓度进行检测，两种方法的检测结果一致性良好 结论结论：QDs 荧光生物检测方法在实际环境水样 PFCs 检测中具有突出的优势，它既具 备了免疫荧光方法的快速和简便的特点，并且通过应用新型荧光标记物 QDs，相对于 传统荧光技术提高了灵敏度和准确性，节约了时间和经济成本，在大样本量的筛选方 面有广阔的应用前景 【关键词关键词】全氟化合物；量子点；荧光；生物检测 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 4 A quantum dots fluorescence bioassay for detecting perfluorinated compounds Master Candidate: Jiong Zhang Supervisor: Professor Baihua Shu Professor Shunqing Xu ABSTRACT Objective: The aim of the present study was to develop a bioassay for detecting and monitoring the concentration of perfluorinated compounds（PFCs）in the environmental water, based on the interaction of perfluorooctane sulphonate（PFOS） 、perfluorooctanoic acid（PFOA）with peroxisome proliferator-activated receptor-α (PPARα) combined with the use of quantum dots (QDs) nanoparticles as a fluorescent marker. Methods: PFOS-BSA was prepared according to the methods as described previously and coated on the 96-microwell plate. Each of the PFOS standards and PPARα-RXRα extract were added to the 96-well plate coated with PFOS-BSA. The supernatants that containing the complex of PPARα-RXRα-PFOS were then transferred to another plate coated with PPARα antibody. Biotin labeled DNA probe was added to each well. The plate was incubated for 1 hr at 37 °C to allow the probe to bind with PPARα-RXRα-PFOS. The QDs-SA was diluted in TBS and added to constitute the fluorescent probe through 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 5 Biotin-Avidin System. At last, we achieved quantitative detection of PFOS by detecting the fluorescence intensity of QDs. And then to make the standard curve by the fluorescence intensity and concentration of PFOS standards，and to detect PFOA using the same method. According to the national standards, we collected water samples and did pretreatment, and then detected the concentration of PFCs by both the bioassay and HPLC/MS, calculated results by the fluorescence intensity and stand curve. Results: In the bioassay, the intensity of fluorescence from each well was linearly related with the PFCs concentrations ranging from 2.5 ng/l to 75 ng/l (PFOS: y = 19.112x-23.995, R2 = 0.964; PFOA: 17.601x-20.914, R2 = 0.973). The detection limit of this method was 2.5 ng/L with the mean recovery being 107.8 % and 110.3 %. In comparison, HPLC/MS demonstrated a limit of detection of 1 ng/l and recovery 104.3 % and 105.9%. The concentration range from 2.5 ng/l to 75 ng/l was within its detection linear range（PFOS: y = 2E-05x-26.479, R2 = 0.996; PFOA: y = 2E-05x-25.023, R2 = 0.997）. To further assess the reliability of the bioassay, water samples collected from the Yangze River in Wuhan, Han River in Wuhan, East lake, waterworks in Wuhan and bottled purified water were detected for PFCs concentration and the results were compared with that determined by HPLC/MS. Detection results of environmental water samples were highly consistent between the bioassay and HPLC/MS. Conclusion: The QDs fluorescence bioassay has outstanding advantages applied in the detection of PFCs in the environmental water samples. It not only has the advantage of immunofluorescence technique, but also improves sensitivity and accuracy compared with the traditional fluorescence method by applying the new fluorescent marker QDs. The 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 6 bioassay has broad application prospects in screening a large number of environmental water samples in the field. Keywords: Perfluorinated compounds (PFCs); quantum dots (QDs); fluorescence; bioassay 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 中英文缩略词表中英文缩略词表 英文缩写 英文全称 中文全称 PFCs PFOA PFOS Perfluorinated compounds Perfluorooctanoic acid Perfluorooctane sulphonate 全氟化合物 全氟辛酸 全氟辛烷磺酰基化合物 QDs Quantum dots 量子点 PPAR Peroxisome proliferator-。