pMD18-T载体说明.pdf

Code No.：D101A Code No.：D101A pMD18-T Vector 目目 录录 内 容 Page 内 容 Page ●制品说明 1 ●制品说明 1 ●制品内容 1●制品内容 1 ●保 存 1●保 存 1 ●纯 度 1●纯 度 1 ●用 途 1●用 途 1 ●pMD18-T Vector 的结构 1 ●pMD18-T Vector 的结构 1 ●实验操作 2 ●实验操作 2 ■Control DNA 片段的克隆实验 ■Control DNA 片段的克隆实验 2 2 ■一般 DNA 片段的克隆实验 2■一般 DNA 片段的克隆实验 2 ●相关说明 3 ●相关说明 3 ●使用注意 4 ●使用注意 4 ●Q&A 4 ●Q&A 4 ●制品说明●制品说明 pMD18-T Vector 是一种高效克隆 PCR 产物（TA Cloning）的专用载体本载体由 pUC18 载体改建 而成， 在 pUC18 载体的多克隆位点处的 pMD18-T Vector 是一种高效克隆 PCR 产物（TA Cloning）的专用载体本载体由 pUC18 载体改建 而成， 在 pUC18 载体的多克隆位点处的XbaXba I 和 I 和SalSal I 识别位点之间插入了 I 识别位点之间插入了EcoEcoR V 识别位点， 用R V 识别位点， 用EcoEcoR V 进行酶切反应后，再在两侧的 3＇端添加“T”而成。

因大部分耐热性 DNA 聚合酶进行 PCR 反应时都 有在 PCR 产物的 3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高 PCR 产物的连接、克 隆效率 R V 进行酶切反应后，再在两侧的 3＇端添加“T”而成因大部分耐热性 DNA 聚合酶进行 PCR 反应时都 有在 PCR 产物的 3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高 PCR 产物的连接、克 隆效率 由于本载体以 pUC18 载体为基础构建而成，所以它具有同 pUC18 载体相同的功能此外，本制品中的 高效连接液 Ligation Mix 可以在极短时间内（约 5 分钟）完成连接反应，且此连接液可以直接用于细菌 转化，大大方便了实验操作本制品中的 Control Insert（500 bp）还可以用于 Control 反应 由于本载体以 pUC18 载体为基础构建而成，所以它具有同 pUC18 载体相同的功能此外，本制品中的 高效连接液 Ligation Mix 可以在极短时间内（约 5 分钟）完成连接反应，且此连接液可以直接用于细菌 转化，大大方便了实验操作本制品中的 Control Insert（500 bp）还可以用于 Control 反应。

●制品内容●制品内容 pMD18-T Vector（50 ng/µl） 20 µl×1 支 pMD18-T Vector（50 ng/µl） 20 µl×1 支 Control Insert（50 ng/µl） 10 µl×1 支 Control Insert（50 ng/µl） 10 µl×1 支 Ligation Mix* 30 µl×5 支Ligation Mix* 30 µl×5 支 * 使用时请于冰中融解 * 使用时请于冰中融解 ●保●保 存：存： -20℃-20℃ ●纯●纯 度度 ■ Control Insert 经克隆后的白色菌落中，有 90%以上含有 Insert DNA 片段 ■ Control Insert 经克隆后的白色菌落中，有 90%以上含有 Insert DNA 片段 ■ Control Insert 经克隆后，用双脱氧测序法确认多克隆酶切位点及 T 碱基的存在 ■ Control Insert 经克隆后，用双脱氧测序法确认多克隆酶切位点及 T 碱基的存在 ●用●用 途途 ■ 进行 TA 克隆，克隆 PCR 产物 ■ 进行 TA 克隆，克隆 PCR 产物。

■ 对克隆后的PCR产物使用■ 对克隆后的PCR产物使用BcaBcaBESTBESTTM TM Sequencing Primers、M13 Primers进行DNA测序 Sequencing Primers、M13 Primers进行DNA测序 ●pMD18-T Vector 的结构 ●pMD18-T Vector 的结构 -1- -1- 【pMD18-T Vector 相关位点说明】 【pMD18-T Vector 相关位点说明】 Cloning site Cloning site 419 419 BcaBcaBEST Sequencing Primer M13-47 binding site BEST Sequencing Primer M13-47 binding site 347~370 347~370 BcaBcaBEST Sequencing Primer RV-M binding site BEST Sequencing Primer RV-M binding site 478~500 478~500 LacZLacZ operator operator 146~469 146~469 ColE1 ori ColE1 ori 852~1466 852~1466 AmpAmpr r1626~2486 1626~2486 ●实验操作●实验操作 ■ Control DNA片段的克隆实验■ Control DNA片段的克隆实验 A）操作方法A）操作方法 1）在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 51）在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 5 µl。

µl pMD18-T Vector*1 1 µl pMD18-T Vector*1 1 µl Control Insert*2 1 µl Control Insert*2 1 µl dH2O 3 µl dH2O 3 µl 2）加入 5 µl（等量）的 Ligation Mix 2）加入 5 µl（等量）的 Ligation Mix 3）16℃反应 30 分钟 3）16℃反应 30 分钟 注） ①注） ① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低 ② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低 ② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低 4）全量（10 µl）加入至 1004）全量（10 µl）加入至 100 µl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟 µl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟 5）42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟 5）42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟 6）加入 890 µl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟 6）加入 890 µl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟。

7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落计数白色、蓝色菌落 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落计数白色、蓝色菌落 8）挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小 8）挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小 B）结 果B）结 果 使用Control Insert时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：1.5×10使用Control Insert时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：1.5×108 8 cfu/µg UC19 DNA cfu/µg UC19 DNA p p Control Insert Control Insert 连接/转化效率 连接/转化效率 （cfu/µg Vector） （cfu/µg Vector） 白色菌落比率 （%）白色菌落比率 （%）效率（%）* 效率（%）* ＋ ＋ 1.7×101.7×106 698.1 98.1 90 以上 90 以上 － － 1.1×101.1×105 540.4 40.4 0 0 * 效率是指白色菌落中的目的 DNA Insert 片段的连入效率。

* 效率是指白色菌落中的目的 DNA Insert 片段的连入效率 ■一般DNA片段的克隆实验■一般DNA片段的克隆实验 1）在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 51）在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 5 µl pMD18-T Vector*1 1 µl pMD18-T Vector*1 1 µl Insert DNA*3 0.1 pmol～0.3 pmol Insert DNA*3 0.1 pmol～0.3 pmol dH2O up to 5 µl dH2O up to 5 µl -2- -2- 2）加入 5 µl（等量）的 Ligation Mix 2）加入 5 µl（等量）的 Ligation Mix 3）16℃反应 30 分钟 3）16℃反应 30 分钟 注） ① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低 注） ① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低 ② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低 ② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低 ③ 长片段 PCR 产物（2 kbp 以上）进行 DNA 克隆时，连接反应时间请延长至数小时。

③ 长片段 PCR 产物（2 kbp 以上）进行 DNA 克隆时，连接反应时间请延长至数小时 4）全量（10 µl）加入至 1004）全量（10 µl）加入至 100 µl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟 µl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟 5）42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟 5）42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟 6）加入 890 µl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟 6）加入 890 µl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落计数白色、蓝色菌落 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落计数白色、蓝色菌落 8）挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小 8）挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小 *1 pMD18-T Vector的使用量*1 pMD18-T Vector的使用量 取 0.5 µl 实验也可得到满意的结果 实际操作时， 可按实验需要确定 T 载体的使用量。

pMD18-T Vector 取 0.5 µl 实验也可得到满意的结果 实际操作时， 可按实验需要确定 T 载体的使用量 pMD18-T Vector 1 µl（50 ng）的摩尔数约为 0.03 pmol 1 µl（50 ng）的摩尔数约为 0.03 pmol *2 Control Insert*2 Control Insert Control Insert 为 500 bp 的 3′末端带有 A 碱基的 PCR 产物，Control Insert 1 µl（50 ng）的摩 尔数约为 0.15 pmol Control Insert 为 500 bp 的 3′末端带有 A 碱基的 PCR 产物，Control Insert 1 µl（50 ng）的摩 尔数约为 0.15 pmol *3 Insert DNA的使用量*3 Insert DNA的使用量 在进行克隆时，Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔比一般为：1 ：2～10 在进行克。