《mallrna的世界》ppt课件.ppt

第四章 RNA世界,对RNA的传统认识,RNA是真正重要的核苷酸DNA的一种一次性使用的拷贝DNA是我们基因和染色体的原料，决定着我们的遗传特征，而RNA只是DNA指令的一个拷贝，是指导蛋白质合成的信使，在旅行职责后被催化分解The Nobel Prize in Chemistry 1989,“for their discovery of catalytic properties of RNA“,RNA World hypothesis,1986，诺贝尔化学奖（ 1981）获得者 W. Gilbert提出“RNA世界”假说： “生命起源 之某时期，生命体仅由一种高分子化合物RNA组成遗传信息传递建立于RNA的复制，复制机理与当今DNA复制机理相似，作为生物催化剂的、由基因编码的蛋白质还不存在”The RNA World“, Nature 319: 618,DNA拷贝出单链RNA，然后RNA被折叠成复杂的形状 RNA的特性,2’羟基——化学性质较DNA活跃，易突变，携带遗传信息能力不如DNA；组成没有蛋白质复杂——不如蛋白质结构多样，功能分子作用不如蛋白质；唯一既能携带遗传信息又可为功能分子的生物高分子化合物。

“RNA世界” 假说—— RNA是生命初期最关键的分子，后来当DNA和蛋白质的功能远远超过最初RNA的作用时，它才退到了次要地位一、核酶（Ribozyme）的发现,1982年， Cech等研究四膜虫rRNA时，发现RNA具有催化功能区别于传统蛋白酶，Cech给这种具有催化活性的RNA 定名为核酶 1983年Altman 等人在研究细菌RNase P时，发现tRNA分子前体的多余序列由RNA切除 1. 新生RNA的剪接和修饰,mRNA tRNA rRNA,mRNA的剪接（mRNA splicing ）,hnRNA /pre-mRNA 核内的初级mRNA称为杂化核RNA (hetero- nuclear RNA, hnRNA)，或mRNA前体（ pre- mRNA）,编码区 A、B、C,断裂基因(splite gene) 真核生物结构基因，由若干个编码区（coding region）和非编码区（non-coding region）互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因内含子的分类,根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类： I：主要存在于核、线粒体、叶绿体编码的rRNA、 mRNA、tRNA基因； II：真菌、藻类、植物之线粒体和叶绿体mRNA； III：是常见的形成套索结构后剪接（剪接体）， 大多数mRNA基因有此类内含子； IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子， 剪接过程需内切酶及ATP。

tRNA前体,,,,DNA,tRNA的转录后加工,,Splicing,,内切酶+连接酶,rRNA的转录后加工,（细菌）,（真核细胞）,2.Cech小组的工作,四膜虫细胞中DNA转录成rRNA后，rRNA中一些无意义的序列，或“内含子”（intron），如何从RNA分子中剪切下来 四膜虫：原生动物，含一种RNA，其组成中除了核糖体RNA外还有一个由414个核苷酸组成的插入序列（intervening sequenc，IVS） 发现：转录产物rRNA前体不稳定，在鸟苷和Mg2+存在下切除自身的413个核苷酸的内含子（IVS），使两个外显子拼接起来，变成成熟的rRNA分子无蛋白质酶参加——自我剪接Cech的实验结论,IVS具有类似蛋白酶的功能，能够打断及重建磷酸二脂键 相信rRNA前体能靠自己完成剪接过程在一定条件下rRNA前体可以按一定方式盘绕，进而自己切割自己，以后再把保留rRNA部分的末端连接起来即它是可以催化自由底物的具有酶活性的RNA RNA分子具有自身断裂的催化作用，以及酶活性的另一个重要方面即催化其他分子的反应3. Altman小组的工作,细菌t-RNA分子的剪接过程 发现：在较高浓度的镁离子和适量精氨酸参与下，核酸酶P（ribonuclease P， RNase P ）中的 RNA能够切割tRNA前体的5’端。

核酸酶P的催化作用是由RNA完成的，而其中的蛋白质在细胞内仅仅起稳定构象的作用二、核酶的作用机制,核酶作用的特点： 具有催化功能的RNA分子 大多通过催化转磷酸酯和磷酸二酯键水解反应参与RNA自身剪切、加工；有些具有RNA 连接酶、磷酸酶等活性 底物可以是不同的分子, 亦可为同一RNA分子中的某些部位 催化效率较蛋白质酶低核酶是一种金属依赖酶,金属离子的作用： 特异的结构作用——提供静电屏障，促进RNA的总体折叠，维持核酶三维结构稳定 参与活性部位的化学反应——二价金属离子（Mg 2+ ）与底物活性部位直接相互作用，参与过渡中间复合物的形成,影响核酶活性的因素,pH值：pH7.0 - 7.5 核酶活性最高 二价金属阳离子（Mg 2+ Mn 2+ ）对活性的影响 抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应 变性剂对活性的影响 温度对活性的影响 ： 65℃范围内随温度升高而增加，37 ℃时均有适宜的活性 不需要能量和蛋白因子,,核酶的分类,1.锤头（Hammerhead)结构核酶,从类病毒中分离出来的一类较小的核酶,底物部分,通常为60个核苷酸左右 同一分子上包括有催化部份和底物部份 催化部份和底物部份组成锤头结构,三个双螺旋区 13个核苷酸残基保守序列 剪切反应在右上方GUX序列的3’端自动发生 催化过程需要二价金属离子参与。

结构特点,作用机制,作用底物,锤头结构的主要类型,R：酶；S：底物，箭头：剪切位点,17位（ X ）的核苷酸残基多数是C，不能是G. 7位核苷酸残基的置换不会对酶活性产生很大影响,两个特殊位点,,人工设计的核酶,粗线表示合成的核酸分子 细线表示天然的核酸分子 X 表示共有序列 箭头表示切断点,特点,催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运 免疫源性低，很少引起免疫反应 通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强应用,基础研究 防治动、植物 病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆，烟草花叶病毒核酶等 基因治疗：肿瘤，乙肝，HIV等3.发夹（hairpin ）结构核酶,存在于三种植物RNA病毒（烟草环点病毒，菊苣黄色斑点病毒型和筷子芥花叶病毒）中 金属离子在催化反应中起结构作用，剪切活性比锤头结构核酶高发夹二级结构模型,二级结构,5环和4螺旋形成两个结构域 剪切反应发生在底物识别序列GUC的5‘端 两个内部环中的碱基及在螺旋区Ⅱ的G11和底物中的G+1都是酶发挥作用所必需的4. HDV核酶,HDV可重复感染乙肝病毒（HBV)感染的RNA病毒，可加重HBV感染症状，导致肝硬化。

1.7kb组成的缺陷型负链RNA病毒，呈环状感染细胞后，通过滚环机制进行的RNA指导的RNA复制，由核酶将长的转录物剪切成单位长度的RNA病毒核心需要乙肝病毒(HBV)的HBsAg进行包装，才能形成具有感染活性的成熟病毒颗粒所以HDV总是伴随HBV感染，否则HDV的感染就是一个自限性的过程而不能形成慢性感染HDV核酶斧头结构模式,三个碱基对的茎；需要二价阳离子；产生5’-OH和 2’,3’-环磷酸,5. 核糖核酸酶 P （RNase P）,组成： 单链RNA分子, 长度为375个碱基；相对分子质量为20kDa的多肽(119个氨基酸残基) 功能：RNA具有催化切割tRNA的能力, 蛋白质则起间接的作用,可能是维持RNA结构的稳定 定位：广泛存在于原核生物和真核生物（核仁、叶绿体和线粒体）中 也参与核糖体RNA的加工大肠杆菌RNase P具有两个组分：一条RNA链（M1-RNA）和一个蛋白质（C5蛋白） 胞内两组分对于功能的发挥都是必要的；体外M1-RNA可以独自发挥催化的功能 C5蛋白主要是增强底物结合的亲和力 真核生物RNase P的RNA链与细菌中所发现的结构相似 ，但独立的RNA无催化活性。

细菌与真核生物RNase P,核糖核酸酶P结合底物tRNA的晶体结构,tRNA,枯草芽孢杆菌,E.coli RNase P中RNA的二级结构,RNase P识别底物的高级结构,RNase P底物的二级结构,6. I类内含子的剪接,Ⅰ型自我剪接内含子粒体基因组中发现，也存在于极少数单细胞真核生物(如嗜热四5′5′膜虫的rRNA)的核基因组中原核体系中少数内含子也是Ⅰ型内含子（如T4噬菌体胸苷酸合成酶基因）内含子切割位点的2个特点,内含子两末端不存在同源或互补序列在剪切的初始阶段，可能直接连接； 连接点具有很短的保守序列——为边界顺序 100种内含子的5′端都是GT；3′端都是AG，因此称为GT-AG法则（GT-AG rule），又称为Chambon法则Ⅰ类内含子的结构特点,边界序列为5′ U↓…… G↓3′,I类内含子剪接机制,I类内含子剪接的机制是二次转酯反应： 细胞中游离GTP上的3′-OH对内含子5′和外显子交界处的U-A之间的磷酸二酯键发起亲核进攻，切开外显子，而其3′-OH和内含子5′端（A）的磷酸形成了新的磷酸二酯键，从而结合到内含子上，这是第一次转酯反应 切下外显子的3′端（U）的-OH基又对内含子3′端交界的磷酸二酯键作亲核进攻，切下内含子，而和外显子2以新的磷酸二酯键相联。

pG-OH (ppG-OH, pppG-OH),,,,Cech用四膜虫为材料来研究真核生物染色体的结构对基因表达的影响,四膜虫rRNA前体的自我剪接,剪接机制,I类内含子的酶学特性 ——四膜虫L-19IVS的体外催化活性,Intervening sequence lacking 19 nucleotide缺少19个核苷酸的居间序列 1986年女科学家Grabowski,P.J.发现L-19可以催化5聚胞苷（5XpC）聚合为多聚胞苷内导顺序,L-19IVS催化RNA寡核苷酸链延长,7. II类内含子剪接,边界序列GT……AG外；分支位点5′GUGCG……YnA 剪接无需鸟苷的辅助，需镁离子的存在 分支点A的2′-OH对5′端外显子和内含子交界处的磷酸二酯键发动亲核进攻切下外显子1，内含子5′的边界序列上的G与5′磷酸和分支点A的2′-OH形成磷酸二酯键，从而产生了套索（lariat）结构； 切下的外显子1的3′-OH继续对内含子3′端的交界序列进行亲核进攻，切下的外显子2′的5′磷酸和外显子1的3′-OH形成磷酸二酯键，连接在一起，同时释放出套索状的内含子II类内含子剪接机制,三、RNA机器制造蛋白质,核糖体能解码一个无限数量的不同mRNA 核糖体是一种非比寻常的催化剂 原子水平的核糖体结构图—— RNA分子发生复杂的折叠，但是有大量的蛋白质支持。

核糖体就是一个核酶，一个RNA催化剂核糖体大亚基,四、microRNA（miRNA）,内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA, 发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成 在细胞内具有多种重要的调节作用每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达1. miRNA的发现,1993年，Victor Ambros &Rosalind C. Lee用经典定位克隆的方法虫 (C. elegans) 中克隆了 lin-4 基因 定点突变发现 lin-4 不编码蛋白，而是产生一种小 RNA 分子这种小 RNA 分子能以不完全互补的方式与其靶 mRNA 的3’非翻译端的特定区域相互作用来抑制 lin-14 的表达，导致 lin-14 蛋白质合成的减少。