动物实验技术8转基因动物.ppt

第十六章第十六章 转基因动物转基因动物ØØ第一节第一节 概述概述ØØ第二节第二节 雄原核注射转基因动物雄原核注射转基因动物ØØ第三节第三节 完全基因剔除转基因动物完全基因剔除转基因动物ØØ第四节第四节 条件基因剔除转基因动物条件基因剔除转基因动物ØØ第五节第五节 ENUENU诱导点突变动物诱导点突变动物ØØ第六节第六节 转基因动物的饲养管理转基因动物的饲养管理第一节第一节 概述概述ØØTransgenic animal : Transgenic animal : 是通过实验手段将新的遗传物质导入动是通过实验手段将新的遗传物质导入动 物胚胎细胞中，并能稳定遗传，由此获得的动物称为转基物胚胎细胞中，并能稳定遗传，由此获得的动物称为转基 因动物ØØ基本原理基本原理: : 将改建后的将改建后的目的基因或基因组片段目的基因或基因组片段用显微注射等方法注用显微注射等方法注 入实验动物的入实验动物的受精卵或着床前胚胎细胞受精卵或着床前胚胎细胞，然后将此受精卵，然后将此受精卵 或着床前胚胎细胞再植入受体动物的或着床前胚胎细胞再植入受体动物的输卵管或子宫中输卵管或子宫中，使，使 其发育成携带有外源基因的转基因动物其发育成携带有外源基因的转基因动物 一、基因整合与表达一、基因整合与表达1. 1.随机整合随机整合无法控制基因插入预先选定的位置，只能接无法控制基因插入预先选定的位置，只能接 受整合到哪里就算哪里的结果。

受整合到哪里就算哪里的结果 即使外源即使外源DNADNA含有与某一条染色体广泛同源含有与某一条染色体广泛同源 的序列，大多数整合仍然是随机的，只有少数的序列，大多数整合仍然是随机的，只有少数 是通过同源交换而实现重组是通过同源交换而实现重组 (1)(1)外源外源DNADNA整合的构型特整合的构型特 点点(2) (2) 外源外源DNADNA整合到染色体上的机制整合到染色体上的机制①①整合常发生在匹配较差的序列之间的不正常交换整合常发生在匹配较差的序列之间的不正常交换 ②②在外源在外源DNADNA及其染色体上的插入位点之间的结合部及其染色体上的插入位点之间的结合部 ，常常包含一段短的，常常包含一段短的DNADNA序列序列( (所谓填充序列所谓填充序列) )，它，它 明显地既不来自外源明显地既不来自外源DNADNA，也不来自染色体也不来自染色体 ③③外源外源DNADNA整合到染色体上的机制尚不能用某一种机整合到染色体上的机制尚不能用某一种机 理来解释理来解释 (3) (3) 外源外源DNADNA整合时间和转基因嵌合体产生整合时间和转基因嵌合体产生①①转基因嵌合体动物是由转基因的和非转基因的两种细胞所转基因嵌合体动物是由转基因的和非转基因的两种细胞所 组成组成( (少数情况下，由两种或两种以上不同类型的转基因少数情况下，由两种或两种以上不同类型的转基因 细胞组成细胞组成) )。

②②转基因嵌合体的产生是由于基因整合时染色体已复制，或转基因嵌合体的产生是由于基因整合时染色体已复制，或 者已整合的基因从一个子染色体上丢失者已整合的基因从一个子染色体上丢失③③一般认为外源一般认为外源DNADNA常常在刚刚完成复制或正在进行复制的常常在刚刚完成复制或正在进行复制的染色体区段整合染色体区段整合2. 2.同源重组同源重组 ①①在原核生物和真核生物中，同源的双链在原核生物和真核生物中，同源的双链DNADNA可以通可以通 过相互交换进行重组过相互交换进行重组②②如果外源如果外源DNADNA含有适当的同源区，也可以通过类似含有适当的同源区，也可以通过类似 的同源重组过程整合到真核生物的染色体上的同源重组过程整合到真核生物的染色体上③③使用显微注射法导入使用显微注射法导入DNADNA，每，每10001000次注射可以产生次注射可以产生 1010个随机整合和一个同源重组整合个随机整合和一个同源重组整合 3. 3.外源基因的表达外源基因的表达 (1)(1)基因座控制区基因座控制区 (LCR)(LCR)基因座控制区是调控基因正确表达的一种重要基因座控制区是调控基因正确表达的一种重要 元件。

元件基因座控制区的作用机制是通过改变其相邻基基因座控制区的作用机制是通过改变其相邻基 因的染色质结构，导致这些基因被转录因的染色质结构，导致这些基因被转录 (2)(2)核基质附着区核基质附着区(MAR)(MAR)MAR MAR序列的基本功能是将染色质的环状域附着序列的基本功能是将染色质的环状域附着 到称为核基质的蛋白质支架上，构成基因组中各个到称为核基质的蛋白质支架上，构成基因组中各个 功能域的边界，相当于基因组中的功能域的边界，相当于基因组中的“ “标点符号标点符号” ” 此外，此外，MARMAR序列的功能没有组织特异性序列的功能没有组织特异性 (3)(3)表达结构的构建和功能域转移表达结构的构建和功能域转移 ①①构建用于生产转基因动物的表达结构，一般都是在构建用于生产转基因动物的表达结构，一般都是在 目的基因的两端各增加一个目的基因的两端各增加一个1 1～～5 kb5 kb的的DNADNA片段，片段， 基本只含有启动子，增强子和多聚腺苷酸化信号基本只含有启动子，增强子和多聚腺苷酸化信号 ②②若要可靠和有效表达目的基因，必须构建和转移完若要可靠和有效表达目的基因，必须构建和转移完 整的功能域，使被转移的基因表达结构包含一切必整的功能域，使被转移的基因表达结构包含一切必 要的调控元件，以便实现不依赖整合位点的有效表要的调控元件，以便实现不依赖整合位点的有效表 达。

达 二、命二、命 名名1 1．符号．符号 (1)(1)一个转基因符号由以下三部分组成：一个转基因符号由以下三部分组成：ØØTgX (YYYYYY) TgX (YYYYYY) ＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃ ZzzZzz，，ØØTgX=TgX=方式；方式；ØØ(YYYYYY)=(YYYYYY)=插入片段标示；插入片段标示；ØØ＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃= = 实验室指定序号；实验室指定序号；ØØZzz = Zzz = 实验室注册代号；实验室注册代号； (2) (2) 方式方式转基因符号通常冠以转基因符号通常冠以TgTg字头随后的一个字母（随后的一个字母（X X）表示）表示DNADNA插入的插入的 方式：方式：H H 代表同源重组；代表同源重组；R R 代表经过逆转录病毒载体感染的插入代表经过逆转录病毒载体感染的插入 ；；N N 代表非同源插入代表非同源插入3 3）插入片段标示）插入片段标示An An 匿名序列；匿名序列； Ge Ge 基因组；基因组；Im Im 插入突变；插入突变； Nc Nc 非编码序列；非编码序列；Rp Rp 报告基因；报告基因； Sn Sn 合成序列；合成序列；Et Et 增强子捕获装置；增强子捕获装置； Pt Pt 启动子捕获装置。

启动子捕获装置 2. 2.举例举例C57BL/6J-TgN(CD8Ge) 23 JwgC57BL/6J-TgN(CD8Ge) 23 Jwg：：来源于美国杰克逊研究所（来源于美国杰克逊研究所（J J）的）的C57BL/6C57BL/6品系品系 小鼠被转入人的小鼠被转入人的CD8CD8基因组（基因组（GeGe）；转基因在）；转基因在Jon Jon W.Gordon (Jwg) W.Gordon (Jwg) 实验室完成，获取于一系列显微实验室完成，获取于一系列显微 注射后得到的序号为注射后得到的序号为2323的小鼠 第二节第二节 原核注射转基因动物原核注射转基因动物一、设计转基因构件一、设计转基因构件转基因构件包括：目的基因、启动子、增强子和标记基转基因构件包括：目的基因、启动子、增强子和标记基 因 1 1、转基因调控序列、转基因调控序列① ①基因组基因组DNADNA构建转基因优于构建转基因优于cDNAcDNA② ②利用利用““管家基因管家基因””启动子指导基因专一性表达启动子指导基因专一性表达③③已有多种组织特异性基因被用于小鼠的转基因已有多种组织特异性基因被用于小鼠的转基因。

2 2、报告基因、报告基因 ①①报告基因能够更为清晰准确地监测外源基因的时空表达报告基因能够更为清晰准确地监测外源基因的时空表达 ②②报告基因都能产生各自特有的化学或发光反应报告基因都能产生各自特有的化学或发光反应 ③③如：如：lacZlacZ、、CATCAT、荧光素酶基因、人生长激素基因、荧光素酶基因、人生长激素基因 和和GFPGFP 3 3、原核载体序列的影响、原核载体序列的影响① ①对转入基因的整合率没有明显影响，但对转入基因的表达对转入基因的整合率没有明显影响，但对转入基因的表达 起抑制作用起抑制作用 ② ②基因构件设计应使基因构件片段与载体序列易于酶切后通基因构件设计应使基因构件片段与载体序列易于酶切后通 过琼脂糖凝胶电泳分离过琼脂糖凝胶电泳分离③ ③BACBAC和和YACYAC中的载体序列似乎对转基因表达影响极小中的载体序列似乎对转基因表达影响极小二、动物操作二、动物操作 1 1、采集受精卵、采集受精卵 2 2、雄原核注射、雄原核注射 3 3、胚胎移植、胚胎移植第三节第三节 完全基因剔除转基因动物完全基因剔除转基因动物ØØ完全基因剔除完全基因剔除(entirely knock-out) (entirely knock-out) ：：又称基因敲除、基因打靶，指应用一段与胚胎又称基因敲除、基因打靶，指应用一段与胚胎 干细胞染色体上的一段序列具有高度同源性的外源干细胞染色体上的一段序列具有高度同源性的外源 DNADNA，通过同源重组直接将靶基因在动物个体中的，通过同源重组直接将靶基因在动物个体中的 活性完全消除，来观察靶基因失活、不表达的情况活性完全消除，来观察靶基因失活、不表达的情况 下会对动物个体产生哪些影响。

下会对动物个体产生哪些影响 一、基因剔除的技术路线一、基因剔除的技术路线二、二、ESES细胞细胞①①ESES细胞在合适的体外培养条件下，可使细胞保持细胞在合适的体外培养条件下，可使细胞保持 分化的全能性分化的全能性 ②②已建立了非常完善的筛选体系，很容易获得同源重已建立了非常完善的筛选体系，很容易获得同源重 组的细胞群体组的细胞群体 三、构建打靶载体三、构建打靶载体1 1、置换型载体、置换型载体 基本元件包括：与靶位点两侧同源的同源序列基本元件包括：与靶位点两侧同源的同源序列 臂、正选择标记基因、细菌质粒序列和载体上同源臂、正选择标记基因、细菌质粒序列和载体上同源 臂外侧的线性化位点臂外侧的线性化位点 2 2、插入型载体、插入型载体主要元件包括：打靶位点的同源序列主要元件包括：打靶位点的同源序列( (至少含至少含 有一个惟一的限制性内切酶位点，可用作线性化位有一个惟一的限制性内切酶位点，可用作线性化位 点点) )、正选择标记框及细菌质粒的骨架正选择标记框及细菌质粒的骨架3 3、选择性标记基因、选择性标记基因 ①①HprtHprt基因：基因：编码次黄嘌呤磷酸核糖转移酶可以将核苷类似编码次黄嘌呤磷酸核糖转移酶可以将核苷类似 物代谢成对细胞有毒性的物质，基因剔除后的细胞物代谢成对细胞有毒性的物质，基因剔除后的细胞 可以在含有核苷类似物的培养基上存活。

可以在含有核苷类似物的培养基上存活②②正正- -负选择系统负选择系统(positive-negative selection(positive-negative selection，，PNS)PNS)载载 体：体：正选择标记基因正选择标记基因neoneo，被插入到靶基因功能最关，被插入到靶基因功能最关 键的外显子中，或。