IPTG诱导外源基因表达.docx

IPTG 诱导表达原理及操作步骤E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、 透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列0、一个启动序列P及一个调节基因 II基因编码一种阻遏蛋白，后者与0序列结合，使操纵子(元)受阻遏而处于 关闭状态在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合 位点由P序列、0序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的 编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达 在没有乳糖存在时， lac 操纵子(元)处于阻遏状态此时， I 序列在 PI 启动序列操纵下表达的 Lac 阻遏蛋白与 0 序列结合，阻碍 RNA 聚合酶与 P 序列结合，抑制转录起动当有乳 糖存在时， lac 操纵子(元)即可被诱导在这个操纵子(元)体系中，真正的诱 导剂并非乳糖本身乳糖进入细胞，经b —半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖后者 作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与 0 序列解 离、发生转录异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂，不被细 菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用材料 1、诱导表达材料 (1 ) LB (Luria_Bert ani)培养基5g10g10g1-2%酵母膏 (Yeast extract)蛋白胨 (Peptone)NaCl琼脂 (Agar) 蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0 适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液2 g IPTG溶于10 mL蒸馏水中，0 • 22 “m滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份, —20 °C保存。

3 ) l X凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS (电泳级)0.1 ％ 溴酚蓝10 ％ 甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 )酶溶法(1) 裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI(2) 50 mmol / L苯甲基磺酰氟(PMSF)3) 10 mg / mL 溶菌酶4) 脱氧胆酸5) 1 mg / mL DNase I2 )超声破碎法( 1 ) TE 缓冲液2 ) 2XSDS -PAGE凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 ％ 溴酚蓝20 ％ 甘油实验方案1、外源基因的诱导表达(1) 用适当的限制性内切核酸酶消化载体 DNA 和目的基因2 )按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌3) 筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA作限制性内切核酸酶图谱,DNA序 列测定，确定无误后进行下一步。

4) 如果表达载体的原核启动子为PL启动子，则在30 -32 °C培养数小时，使 培养液的OD600达0.4-0.6，迅速使温度升至42 C继续培养3-5h ；如果表达 载体的原核启动子为tac等，则37 C培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L继续培养3 -5h5) 取上述培养液1 mL , 1000g离心，1 min，沉淀，加100卩L聚丙烯酰胺 凝胶电泳上样缓冲液后，作 SDS -PAGE 检测2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化1 )细菌的裂解常用方法有：①高温珠磨法；②高压匀浆；③超声破碎法；④酶溶法；⑤化 学渗透等前三种方法属机械破碎法，并且方法①、② 已在工业生产中得到应 用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤1)酶溶法常用的溶解酶有溶菌酶；P -1,3 -葡聚糖酶；p -1,6 -葡聚糖酶； 蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵 母作用显著主要步骤为：①4 C ， 5000rpm离心，15 min，收集诱导表达的细菌培养液(100mL)弃上 清，约每克湿菌加 3 mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀。

目的蛋白的诱导表达和纯化(1) 菌在含氨苄青霉素(100 mg/L)的LB培养基中37 C振摇培养过夜(2) 按10%的接种量转接入新鲜LB培养基，250 rpm, 37C摇菌至^=1(3) 加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，37C继续通气培养4〜5 h 6°°(4) 分别于2h、4h各取1.5 mL菌液，7734g离心30s收集菌体(5) 菌体加入HO 60 p L，剧烈振荡混匀，再加入4X样品缓冲液20 p L，100C,2、.5 min； 7734g 离心 5 min；(6) %SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，考马斯亮蓝染色后观察诱导结果(7) 大规模培养细菌 ,诱导表达目的蛋白 ,离心,收集菌体 ,将菌体重悬于 lysis buffer,超声破菌(8) 离心后将上清和沉淀分别制样，进行 SDSPAGE(9) 可溶的目的蛋白直接应用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱进行亲和层析纯化 . 以 包涵体形式存在的表达产物. 用 N 十二烷基肌氨酸钠将沉淀蛋白质变性过夜，经 缓慢透析去除 N 十二烷基肌氨酸钠，令蛋白复性后，用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析 柱对目的蛋白进行亲和层析纯化(10) 先以5〜10个柱体积(CV) PBS缓冲液平衡柱，流速1.5ml/min;样品液10 ml上样，流速为0.5 ml/min,用5〜10 CV缓冲液洗脱未结合的物质；5 CV的 洗脱液洗脱目标蛋白, 流速 1.5 ml/min, 收集洗脱液。

10%聚丙烯酰胺凝胶电泳 鉴定表达产物, 检测表达产物的分子量及纯化效果重组质粒在大肠杆菌中的表达及纯化将阳性重组质粒转化至BL21中，选取多个重组菌落接种LB液体培养基中 37 °C振摇培养过夜，按1 : 100比例转入新鲜LB培养基，培养至OD值为1.0 时，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG继续诱导培养3 h离心，收集菌体将 诱导后的菌体重悬于lysis buffer,超声破碎后离心去沉淀，收集样品液GSTrapFF 柱亲和层析纯化重组蛋白 先以 5〜 10 个柱体积 ( CV) PBS 缓冲液 平衡柱， 流速 1.5 ml/min; 样品液 10 ml 上样， 流速为 0.5 ml/min， 用 5〜 10 CV缓冲液洗脱未结合的物质；5CV的洗脱液洗脱目标蛋白，流速1.5ml/min，收 集洗脱液 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS-PAGE) 鉴定表达产物， 检测表达产物 的分子量及纯化效果铺板培养12h后挑取阳性克隆，37°C、300Xg培养至菌液A260=0.6时，加入终 浓度为1mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达分别于2h、4h各 取菌液100ML,离心收集细菌沉淀，行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后观察 诱导结果。

大量菌液37C 1mmol/L IPTG诱导表达4h后回收细菌沉淀将诱导的蛋白用纯化 包涵体的方法进行初步纯化 ， 然后进行 SDS-PAGE 电泳 ， 回收包涵体. 将切下的 目的蛋白条带用电洗脱方法回收GST 亲和层析原理谷胱甘肽转硫酶(Glutathion S-transferases，简称GSTs, EC2.5.1.18)广泛存在于动物和人体 的各种组织，是由多个基因编码的、具有多种功能的一组同功酶，分子量为 23-29KD GST 蛋白能与亲和介质上的谷胱甘肽(GSH)通过硫键共价亲和，再用还原性谷胱甘肽竞争GST 上的结合位点将GST蛋白洗脱下来，从而达到纯化的目的1ml树脂大约可结合5-8 mg融合 蛋白，并可反复使用数次试剂IPTG (异丙基硫代-0D-半乳糖苷)：2g IPTG溶解入10ml水，过滤除菌，分装，-20°C保存Lysis buffer (50ml)1) 2.5ml 1 M Tris， pH8.02) 0.1ml 0.5ml EDTA3) 0.292g NaCl4) 0.5ml Triton X-1005) 0.25ml 1M DTT u Elution buffer1) 0.615g glutathione2) 10 ml 1M Tris，pH8.03) 90ml distilled water .操作步骤1） 挑一个克隆至2ml LB液中（Amp+ ）2） 37 °C振摇至OD600值约为0.63） 将2ml菌液加入100 ml LB中4） 37 C振摇至OD600值约为0.65） 加入IPTG至终浓度为1mM6） 继续摇3〜4h7） 离心（5000 rpm, 5min, 4C）8） 用10x柱体积的lysis buffer悬浮细菌9） 超声破碎细胞10） 离心（12,000rpm,15min,4C）,取上清11） 用滤纸过滤12） 加 0.5 ml 50%谷胱甘肽琼脂糖 beads 于层析柱13） 5x柱体积的lysis buffer洗层析柱14） 样品过柱15） 5x柱体积的lysis buffer洗层析柱16） 3x柱体积的elution buffer洗脱蛋白17） 收集蛋白：0.5ml/管18） 取20ml样品SDS-PAGE鉴定可以在buffer里增加点蛋白酶抑制剂，防止蛋白的降解。

GST亲和层析基本操作步骤介质/层析柱准备（用平衡液平衡至平稳）样品准备（含GST或融合蛋白的滤液）柱分离：上柱：将滤液上柱平衡：用平衡液洗去杂蛋白，至无蛋白流出洗脱：用洗脱液洗脱，收集洗脱峰一般平衡液用PBS，洗脱液用含10mM的还原型谷胱甘肽的Tris溶液。