版药典无菌检查法与微生物鉴定.ppt

20152015版药典无菌检查法与版药典无菌检查法与微生物鉴定方法微生物鉴定方法抗生素室1 1•无菌 是指某一物体或某一环境中不含有活的微生物•无菌检查法 用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法• 无菌操作 是指在无菌环境条件下，在对无菌制品或无菌器械等 进行检验的过程中，能防止微生物污染与干扰的一种常规操作方法2 2• 无菌技术 是指在微生物试验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施、无菌试验器材及无菌操作• 无菌检查法的局限性 由于无菌是一个相对的概念，因此，对无菌检查的结果应该有一个正确的认识－即产品通过无菌检查仅仅意味着在该检验条件下，供试品未发现有微生物污染，并不表示所有的产品都是无菌的反之，当供试品中检出微生物污染，则可以认为批产品的微生物污染风险相当高3 3从理论上来说，要确定某批产品的无菌性，应对每个容器进行无菌检查但是无菌试验对样品是破坏性的，因此不可能对每一最小包装的产品进行检查统计概率的局限性 ：对于低污染水平的产品，其局限性在统计学上更为明显。

检验条件的局限： 样品中污染的微生物的检出受多种因数的影响，只有在各检验条件符合污染微生物的修复和生长时，才能保证被检样品的无菌检验结果的准确性 污染的检出率要比实际产品的污染率低4 4无菌检查存在检查失误的可能性：这可能是因为污染菌浓度太低，或是污染菌生长太慢，或是因为培养基不良等原因，在培养期间污染菌根本就不生长产品的染菌率愈小，错判合格的可能性就愈大所以在评价某个无菌制品的某个批的无菌状态时，仅依靠最终产品的无菌检查是不充分的，局限性较大对无菌制品来说，生产最终产品的所有系统的工艺才是最重要的5 52015版中国药典无菌检查法•2015版中国药典无菌检查法的修订•无菌检查法的方法适用性试验•无菌检查法的注意事项6 62015版中国药典无菌检查法的修订•实验环境的修订•检查用培养基的修订•具体修订内容7 7实验环境的修订2010年版年版2015年版年版无菌检查： 应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流空气区域内或隔离系统中进行 无菌检查： 应在洁净度B级背景下的局部A级单向流空气区域内或隔离系统中进行 微生物限度检查： 应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流空气区域内进行。

 微生物限度检查： 应在受控洁净环境下（不低于D级）的局部不低于B级单向流空气区域内进行8 8修订的依据修订依据及意义：2010版GMP附录一《无菌药品》和附录三《生物制品》中均规定，非最终灭菌产品各工序关键操作环境应为B级背景下的A级无菌检查的洁净环境不得低于生产关键区的洁净环境要求！ICH：检查方法中要求“试验应在无菌条件下进行，防止微生物污染的措施不得影响供试品中微生物的检出”9 92015版中国药典通则9203 药品微生物实验室质量管理指导原则9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则1010GMP2010年版年版对洁净度的度的规定及确定及确认标准准－－50100200不作规定不作规定不作规定不作规定29000D级级－－2550100290002900352000C级级555102900352000293520B级级< <1< <1< <1< <120 3520203520A级级5指手指手套套cfu /手手套套接触碟接触碟/（（f f55mm））cfu /≥5.0μm≥0.5μm≥5.0μm≥0.5μm表面微生物表面微生物沉降沉降菌菌（（f f90mm））cfu /4h(2)浮游浮游菌菌cfu/m3动态动态静态静态微生物监测的动态标准微生物监测的动态标准(1)悬浮粒子最大允许数悬浮粒子最大允许数/立方米立方米洁洁净净度度级级别别1111无菌隔离系统的使用及验证92069206 无菌检查用隔离系统验证指导原则无菌检查用隔离系统验证指导原则•1.操作验证•2.完整性验证•3.灭菌验证•4.灭菌循环验证•5.内部洁净度验证•6.仪器仪表验证12121313培养基的修订•我国药典无菌检查法与欧美药典的差异•2015版药典的修订1414比较项目ChP2010USP35EP7.0检验条件规定总体10000级、局部100级应在无菌条件下进行。

 应在无菌条件下进行人员要求具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训 经培训和认可 经培训和认可 培养基、培养条件与时间 硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃；20～25℃(三部）改良马丁培养基 23～28℃均培养14天，转种后细菌培养2天、真菌培养3天硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃胰酪大豆胨液体培养基20～25℃   培养不少于14天转种后培养不少于4天硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃胰酪大豆胨液体培养基 20～25℃培养不少于14天转种后培养不少于7天培养基灵敏度检查与方法验证用菌株金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉检验方法只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法性状允许的样品采用薄膜过滤，利于抗菌影响去除采用薄膜过滤，利于抗菌影响去除稀释剂与薄膜过滤冲洗液1、0.1％蛋白胨水溶液；2、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液3、其他经验证过的溶液1．0.1%蛋白胨水溶液；2．0.1%蛋白胨水溶液＋1ml吐温803．动物组织消化液＋牛肉浸膏＋吐温801．0.1％蛋白胨水溶液2．0.1％蛋白胨水溶液＋0.1％（聚乙氧基乙醇、0.1％吐温-80）3．十四烷酸异丙酯。

 结果判断与复试规定一次检出结果为准 (设备及环境不符合要求、实验过程有可能引起污染的因素、阴性对照有菌生长、分离微生物可明确归因于无菌实验过程中所用的材料或技术错误造成的单倍量重试)15152010年版年版2015年版年版硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃（20～25℃）硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃（20～25℃）改良马丁培养基23～28℃胰酪大豆胨液体培养基22～25℃营养肉汤培养基沙氏葡萄糖液体培养基胰酪大豆胨液体培养基营养琼脂培养基胰酪大豆胨琼脂培养基改良马丁琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基的主要修订培养基的主要修订1616硫乙醇酸盐流体培养基（Fluid Thioglycollate Medium）药典USPBP中国药典-2015名称Fluid Thioglycollate Medium 硫乙醇酸盐流体培养基Fluid Thioglycollate Medium 硫乙醇酸盐流体培养基Fluid Thioglycollate Medium 硫乙醇酸盐流体培养基目的培养需氧、厌氧和微需氧微 生物（主要是厌氧菌）培养需氧、厌氧和微需氧微 生物（主要是厌氧菌）培养需氧、厌氧微生物培养条件14天于30-35 °C及20-25 °C配方Pancreatic Digest of Casein(胰酪蛋白胨)....................15.0 g Yeast Extract(酵母浸出粉) ..................................5.0 gDextrose(葡萄糖)............................................5.0 gSodium Chloride(氯化钠).....................................2.5 gL-Cystine( L-胱氨酸) .......................................0.5 gSodium Thioglycollate (硫乙醇酸钠)..........................0.5 g Agar( 琼脂).................................................0.75 gResazurin( 刃天青) .........................................1.0 mgWater（水）............................................. ...1000ml    1717大豆胰酪胨培养基(TSB) & 改良马丁培养基药典USP36BP-2013中国药典2010版中国药典2015版名称Tryptic Soy Broth （Soybean casein digest medium)大豆－胰酪 胨培养基改良马丁培养基胰酪大豆胨液体培养基配方胰酪蛋白胨..…………….…..7.0g 大豆木瓜蛋白酶消化物………………………………….3.0g氯 化 钠 …..…………….…….…5.0g 磷酸氢二钾…………………....2.5g 一水葡萄糖……………….……2.5g蛋白胨……………..5.0g 酵母浸出粉…….…2.0g葡萄糖…………....20.0g 磷酸氢二钾………..1.0g硫酸镁(MgSO4.7H2O)….0.5g胰酪胨 „„„„„17.0g 大豆木瓜蛋白酶水解物„„„„„„„„„3.0g氯化钠 „„„„„„5.0g磷酸氢二钾„„„„„2.5g葡萄糖/无水葡萄糖„„„„„„„2.5g /2.3g目的支持广泛微生物的生长,包括需氧菌 专性和兼性厌氧菌、真菌（主要是 需氧菌）用于培养真菌支持广泛微生物的生长,包 括需氧菌、专性和兼性厌氧 菌、真菌（主要是需氧菌）培养 条件14天于30-35 °C及20-25 °C14天于20-25 °C14天于30-35 °C及20-25°C18182010年版年版2015年版年版金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种到营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物接种到胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基生孢梭菌的新鲜培养物接种至硫乙醇酸盐流体培养基生孢梭菌的新鲜培养物接种至硫乙醇酸盐流体培养基白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基白色念珠菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖液体培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂培养基黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基菌液制备用培养基的修订菌液制备用培养基的修订19192010年版年版2015年版年版硫乙醇酸盐流体培养基：金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基：金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌生孢梭菌改良马丁培养基：白色念珠菌黑曲霉胰酪大豆胨液体培养基：枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉培养基灵敏度检查培养基灵敏度检查2020无菌检查方法的整合     以2010年版药典二部为基础，整合保留了生物制品无菌检查法的特点，在检验数量、检验量、阳性对照、培养温度方面互相兼顾。

       生物制品的无菌检查中硫乙醇酸盐流体培养基为双份，分别置30～35℃、20～25℃两个温度培养       USP/EP/BP/JP/ICH无菌检查法中对生物制品均没有作出特殊规定2121无菌检查方法的主要修订•“方法验证试验”修订为“方法适用性试验”•“若该产品的组分或原检验条件发生改变时，检验方法应重新验证”修订为“若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验•“方法适用性试验”培养时间由“3～5天”修订为不得超过5天22222010年版年版2015年版年版硫乙醇酸盐流体培养基接种小于100cfu的菌液：金黄色葡萄球菌大肠埃希菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基接种小于100cfu的菌液：金黄色葡萄球菌大肠埃希菌生孢梭菌改良马丁培养基接种小于100cfu的菌液：白色念珠菌黑曲霉胰酪大豆胨液体培养基接种小于100cfu的菌液：枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉方法适用性试验的修订方法适用性试验的修订2323• 检验数量：是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量成品每亚批均应进行无菌检查• 2015版药典四部通则1101表2，上市抽验样品的最少检验数量，除抗生素和血液制品外，V≥100ml液体制剂的最少检验数量由2010年版药典6瓶/支修订为10瓶/支。

即所有上市抽验样品除抗生素和血液制品外的最少检验数量为10瓶/支增加了供试品检验数量2424252526262010年版年版2015年版年版硫乙醇酸盐流体培养基：4种金黄色葡萄球菌大肠埃希菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基：3种金黄色葡萄球菌大肠埃希菌生孢梭菌改良马丁培养基：2种白色念珠菌黑曲霉胰酪大豆胨液体培养基：3种枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉方法适用性试验用菌株方法适用性试验用菌株无菌检查法的方法适用性试验2727菌液制备要点•新鲜培养物，混匀•每一稀释剂更换吸管•生孢梭菌可以用硫乙醇酸盐流体培养基计数，一般16～18h内观察2828菌液制备要点•采用琼脂斜面上的培养物制备菌液时，尽量使菌苔分散•黑曲霉可制成稳定的孢子悬液保存在2～8℃•对于同一份试验菌培养物，采用相同的稀释步骤，不同的实验人员对菌数的测定结果可能存在较大的差异2929铜绿假单胞菌 [CMCC(B B) 10104]大肠埃希菌 [CMCC(B B) 44102]金黄色葡萄球菌 [CMCC(B B) 26003]生孢梭菌 [CMCC(B B) 64941]枯草芽孢杆菌 [CMCC(B B) 63501]G-杆菌G+球菌 酵母菌霉菌兼性需氧菌专性厌氧菌专性需氧菌白色念珠菌 [CMCC(F F) 98001]黑曲霉 [CMCC(F F) 98003]G+芽孢杆菌3030•大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌需氧层厌氧层均生长。

•枯草芽孢杆菌仅在需氧层生长•生孢梭菌仅在厌氧层生长3131取样量的确定例： 批生产量>500个的规格为1ml的注射液，表1规定接种每种培养基的最少检验数量为20个或2％（取较少者），表3规定全量接种 直接接种法 每管培养基接种样品的量×6验证（一次） 薄膜过滤法 每株菌20瓶，6株菌120瓶 直接接种法 40瓶+阳性无菌检查 薄膜过滤法 40瓶+ 20瓶（阳性）=60瓶 3232方法适用性试验结果的判断：•与对照管比较，如含供试品的各试验管的实验菌均生长良好，可照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查•如含供试品的任一试验管的实验菌生长微弱、缓慢或不生长，可采用增加冲洗量、增加培养基用量、使用中和剂、更换滤器品种等方法，重新进行方法验证3333无菌检查法的注意事项培养基的要求：•灵敏度检查符合规定•硫乙醇酸盐流体培养基氧化层：     接种前：培养基氧化层的高度不超过培养基深度的1/5，否则须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止过程中污染。

     培养后：装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层不超过培养基的1/23434检验方法的选择•薄膜过滤法：一般采用封闭式滤器只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法•直接接种法：适用于无法用薄膜过滤法进行实验的品种3535•供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适用性试验确认的方法相同•无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性3636常用中和剂比例•0.1％大豆卵磷脂•0.1~1％吐温80•卵磷脂、吐温80及L－组胺酸用于中和醛类及酚类化合物•卵磷脂及吐温80中和季铵盐•卵磷脂中和氯己定•吐温80中和双三氯酚及汞化合物3737薄膜过滤法•水溶性供试液过滤前应先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜•油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥•为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面•供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，且总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤3838直接接种法•除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，胰酪大豆胨液体培养基每管装量不少于10ml。

供试品检查时，培养基的用量和高度同方法适用性试验•接种生物制品供试品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成两等份，一份置30～35℃培养，一份置20～25℃培养3939供试品的无菌检查• 阳性对照  应根据供试品特性选择阳性对照菌：•无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；•抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；•抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；•抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌•阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小于100CFU，供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量•阳性对照管培养72 小时应生长良好4040供试品的无菌检查•阴性对照 供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照阴性对照不得有菌生长4141培养和观察•硫乙醇酸盐流体培养基置3030～～35℃35℃，，胰酪大豆胨液体培养基置2020～～25℃25℃，培养14天•逐日观察记录•阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长•无菌检查一次检出！•培养基浑浊，培养14天后不能判断： 转种至同种新鲜培养基中，培养三天，或取培养液涂片，染色镜检。

4242结果判断•阳性（+）阴性（-）• 供试品管浑浊，即判不合格 除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含的微生物•设备，环境的微生物监控结果超标• 回顾实验过程，发现污染因素•鉴定微生物，确认是操作引入的•无菌试验经确认无效，可重试4343实验过程监控•表面监控表面监控•环境菌监控环境菌监控•手部监控手部监控4444环境微生物归属：环境微生物归属： 约大于50％的革兰氏阳性菌来自人员；30％的革兰氏阳性芽孢杆菌来自产品外包装；酒精对革兰氏阳性芽孢杆菌无效；革兰氏阴性假单胞菌存在于新洁尔灭中；丁基胶塞会因负压而将消毒剂中的污染菌引入样品4545无菌程序保障•无菌检查样品前处理：无菌检查样品前处理：分批消毒、实验（混合）→ 统一消毒，统一实验•严格遵守外表面消毒程序：严格遵守外表面消毒程序：一般环境酚类 ，洁净环境过氧乙酸+75%乙醇（无菌级）•增加过程监控力度：增加过程监控力度：表面菌采样、手部采样（每批）、动态浮游菌采样（下风口）4646微生物鉴定•微生物鉴定指导原则(通 则 9204)：为非无菌药品微生物限度控制菌检查中疑似 菌的鉴定，以及药物原料、辅料、制药用水、中间体、终产品和环境中检出微生物的鉴定提供指导。

•当微生物的鉴定结果有争议时，以 《 伯杰氏系统细菌学手册 》 《 Bergey’ s  Manual  of  Systematic  Bacteriology》现行版的鉴定结果 为准4747微生物鉴定         微生物鉴定是指借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，  或属、种及菌株水平确定的过程，它是药品微生物检验中的 重要环节，药典通则相应章节中对检出微生物的鉴定做了明 确规定，如 “非无菌产品的微生物检查：控制菌检査（通则 1106) ” 中选择培养基或指示培养基上发现的疑似菌落需进 行鉴定；对 “无菌检查法(通 则 1101) ” 的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定，以判定试验是否重试；“药品洁净实 验室微生物监测和控制指导原则（通 则 9205) ” 中建议对洁 净室和其他受控环境分离到的微生物进行鉴定，以掌握环境 微生物污染情况，有助于污染调查4848微生物分类界界 （（Kingdom）） (Regnum)门门 （（Phylum）） (Phylum)纲（纲（Class）） (Classis)目（目（Order）） (Ordo)科（科（Family）） (Familia)属（属（Genus）） (Genus)种（种（Species）） (Species)4949微生物分类•每一分类单位之后可有亚门、亚纲、亚目、亚科.....•词尾：门：-phyta，纲：-mycetes，目：-ales，科：-aceae，亚目：-ineae，亚科：-oideae。

5050种：是最基本的分类单位，一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近，与同属内其他种有明显差别的菌株的总称 •客观存在，相对稳定•来自共同祖先，有着相近的亲缘关系•形态、生理特征上表现十分相似•存在差异和变异•变异发展到一定程度，即形成新种或变种5151•变种 ：种内某一个体可能由于突变而发生变异，在自然选择和人工选择下，这种变异会在种内不断扩散，最后形成某些遗传性不同于原种的一个群体•亚种：指某一明显而稳定的特征与模式种不同的种，有时称小种 在微生物学中，通常把实验室所获得的变异菌株称之为亚种•型：同种微生物彼此之间的区别不如变种显著，一般表现在菌体的化学组分上如：结核杆菌人型、牛型和禽型5252•菌株（strain）：又称品系，指一种微生物的不同来源的纯培养物，在微生物学的研究中运用最为广泛从自然界中分离到的每一个纯培养物都可以称为一个菌株或品系•自然界“种”——有限，菌株——无限5353       微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定和菌株分型大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环 境的风险评估中，对所检出微生物的常规特征包括菌落形态 学、细胞形态学（ 杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等）、革兰染色或其他染色法、及某些能够给出鉴定结论的关键生 化反应（如氧化酶、过氧化氢酶和凝固酶反应)进行分析，一 般即可满足需要；非无菌产品的控制菌检査一般应达到种 属的水平；无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培 养基灌装） 失败时，对检出的微生物鉴定至少达到种属水平 ，必要时需达到菌株水平。

5454菌株保藏中心•美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC）•美国农业研究菌种保藏中心（NRRL）•德国微生物菌种保藏中心（DSMZ）•荷兰微生物菌种保藏中心（CBS）•英国微生物菌种保藏中心（NCTC）•中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）•医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）5555微生物鉴定条件•待鉴定的微生物必须是纯种微生物，在鉴定前，需将菌株纯化，获得纯培养物 •选取权威鉴定手册•选择适当鉴定方法，确定主要测试项目5656微生物鉴定程序•待检菌的分离纯化•初筛试验•表型微生物鉴定•基因型微生物鉴定5757经典鉴定方法•形态特征：大小，排列，分化，结构，染色等•培养特征：营养要求，生长的物理环境（酸碱 度，温湿度），菌落，菌苔，液体 培养特征•代谢特征：微生物生命活动的方式如：I.M.Vit•化学组成特征：细胞主要特征性化学成分的鉴定 如：细胞壁成分、细胞内含物•抗原特征：抗原成为化学组成的一个特殊方面，微生物具有许多不同类型的抗原•生态特征：与其他生物的关系、自然界的分布、致病性等5858待检菌的分离纯化       最常用 的分离纯化方法是挑取待检菌在适宜的固体培养基上连续划 线分离纯化，以获取待检菌的纯培养物（单个菌落）。

5959各类微生物的菌落特征微生物类别菌落特征单细胞微生物菌丝状微生物细菌酵母菌放线菌霉菌主要特征细胞形态特征小而均匀、个别有芽孢大而分化细而均匀粗而分化相互关系单个分散或按一定方式排列单个分散或假丝状丝状交织丝状交织菌落含水情况很湿或较湿较湿干燥或较干燥干燥外观特征小而突起或大而平坦大而突起小而紧密大而疏松或大而致密参考特征菌落透明度透明或稍透明稍透明不透明不透明菌落与培养基结合度不结合不结合牢固结合较牢固结合菌落的颜色多样单调十分多样十分多样菌落正反面颜色差别相同相同一般不同一般不同细胞生长速度一般很快较快慢一般较快气味一般有臭味多带酒香常有泥腥味霉味6060初筛试验•常规的微生物鉴定，一般要先进行初筛试验确定待检菌的基本微生物特征，将待检菌做初步分类•常见的初筛试验包括革兰染色、芽孢染色、镜检观察染色结果和细胞形态、重要的生化反应等6161区分葡萄球菌(过氧化氢酶阳性）和链球菌(过氧化氢酶阴性）过氧化氢酶及过氧化物酶实验：         2H2O2 过氧化氢酶 2H2O+O2 过氧化物酶：RH2+H2O2 过氧化物酶 R+2H2O 阳性：细菌变为黑褐色，有气泡产生； 阴性： 不变色。

阳性阴性6262区分不发酵的革兰阴性杆菌（氧化酶阳性）和肠道菌（氧化酶阴性）细胞色素氧化酶实验：         细胞色素C 细胞色素氧化酶 氧化型细胞色素C +对苯二胺 +   --奈酚 靛酚兰（蓝色） 阳性： 2分钟内生成蓝色为阳性； 阴性：无变化阳性阴性6363•凝固酶实验：区分凝固酶阴性葡萄球菌（ 可推测为非致病性）和凝固酶阳性葡萄球菌(很可能为致病玻片法性） 试管法6464柠檬酸盐实验（枸橼酸盐实验）： 一些微生物可以以铵盐作为唯一的氮源，以柠檬酸盐作为唯一的碳源，在柠檬酸盐培养基上生长，分解柠檬酸盐生成碳酸盐，使培养基变成碱性，酸碱指示剂变色阴性阳性6565甲基红实验（MR实验） ：                一些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可被进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸而使培养基的pH值下降到4.5以下，加入甲基红指示剂出现红色反应阴性阳性6666V-P实验： 一些细菌分解葡萄糖为丙酮酸，进一步脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化成二乙酰丁二酮，进而与培养基内蛋白胨中所含的精氨酸的胍基发生反应生成红色化合物。

阴性阳性6767表型微生物鉴定6868表型微生物鉴定       在表型鉴定时应注意采用的培养基、培养时间和传代次数对鉴定结果的影响目前已有的基于碳源利用和生化反应特征的鉴定方法，如气相色谱法分析微生物的脂肪酸特征、MALD1-TOF质谱法分析微生物蛋白等微生物鉴定系统，在进行结果判断时需借助于系统自身的鉴别数据库，还依赖特定的培养基和培养方法以确保鉴定结果的一致性6969生长在固体培养基上的菌落全细胞 MALDI-TOF谱图数据库中参考谱图输出可信鉴定结果找到匹配度最可信的谱图7070各菌种代表性峰型分布存在显著差异，有助于鉴定各个菌种！各菌种代表性峰型分布存在显著差异，有助于鉴定各个菌种！7171基因型微生物鉴定•与表型特征不同，微生物基因型通常不受生长培养基或分离物活性的影响，只需分离到纯菌落便可用于分析•由于大部分微生物物种中核酸序列是高度保守的，所以 DNA- DNA杂交、聚合酶链反应、16S rRNA序 列 和 18S rRNA 序列、多位点序列分型、焦磷酸测序、DNA探针和核糖体分型分析等基因型微生物鉴定方法理论上更值得信赖•基因型的鉴定可通过DNA杂交、限制性酶切片段图谱 的比较和/ 或D NA探针完成，若 DNA -DNA的杂交亲缘关系大于70%时，表明微生物是同一种属。

7272基因型微生物鉴定 rRNAs记录了微生物的进化历史，对这些序列进行分析可以对微生物进行系统分类和鉴定7373•16S rRNA被普遍公认为是一把好的谱系分析的“分子尺”，可以作为测量各类生物进化的工具•rRNA在细胞中含量大(约占细胞中RNA的80%)，也易于提取•rRNA具有重要且恒定的生理功能•16SrRNA普遍存在于真核生物和原核生物中(真核生物中其同源分子是18SrRNA)•16SrRNA分子量大小适中，便于序列分析•在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究7474APl Listeria 　　20EAPI 1OSAPIVITEK7575APl Listeria 　　20EAPI 1OSBD PHOENIX™全自动微生物鉴定系统全自动微生物鉴定系统GenomeLab GeXP遗传分析系统遗传分析系统 　　7676溯源分析•溯源分析是通过对污染微生物和相关环节监控微生物进行比对，以同源性的差异程度为依据，确认污染来源的过程•菌株水平的鉴定在污染调查过程中非常重要，尤其适用于产品中的微生物数量高于建议水平或出现异常高的微生物 检出情况时。

菌株水平的鉴定在无菌工艺中也很重要，在无菌试验结果阳性和培养基灌装等模拟工艺失败时，应对检出的微生物进行评估7777溯源分析       实际工作中无菌试验阳性结果中分离出的微生物，经对 其溯源分析，确认污染归因于无菌试验过程中所使用的材料 或无菌技术的差错，该试验可判无效，否则判该产品不符合要求对洁净室和其他受控环境分离到的微生物进行适当比率的鉴定，掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查7878《《伯杰氏系统细伯杰氏系统细 菌学手册菌学手册 》》(Bergey’ s Manual of Systematic Bacteriology)•美国宾夕法尼亚大学的细菌学教授伯杰(D.Bergey)(1860-1937)7979•《伯杰氏系统细菌学手册》•1923年第一版 1948年第六版•1925年第二版 1957年第七版•1930年第三版 1974年第八版•1934年第四版 1994年第九版•1939年第五版80808181。