流式细胞仪操作步骤.docx

流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)一、开机程序：1. 检查鞘液桶和废液桶确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位 置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足 够空间容纳本批标本排弃的废液如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中 气压2. 依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印 机3. 气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以 排除管路中气泡二、 运行FACSComp软件、检查仪器状况1. 制备三色标准微球样本一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入 1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度2. 机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径选择所需校 正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号3. 在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过 程中是否需要清洗样品4. 上样品，微球溶液上样之前要充分混匀功能键设置在“RUN”5. 仪器自动检查，并做电压、补偿等设置6. FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试7. 做 Set up8. 打印校正结果，退出FACSComp程序。

备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是 在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准 确在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“ Low” “S tandby "状态三、 样品分析软件：CellQuest Pro1・ 保证机器预热5 min,打开CellQuest Pro软件，选择“联机”Acq J Connec t（1）在弹出的界面中的选择数据存储路径（Directory菜单）；3）对实验样本进行命名； 对实验通道进行预设（ FSC， SSC， FL1-FL4） 备注：如果界面被关闭，重新调出步骤：Wind Show2.调出质控模板Cyto Instrume® OpBD选择调用BDInstrumeOp, —倏也（Do改为Acquire〉 ，更改横纵坐标表示名称，设置十字象限如果要做四色实验，则绘制四个图备注：第一个散点图横坐标为FSC,纵坐标为SSC1） 设定获取细胞数目：个细胞2） 调出电压、阈值和补偿等界面3） 将所有补偿调为0I（4） 将非52的阈值调为0ThreAcqComplAcquisi ■厂般获取 10000从工具栏Cytometer3. 画图选择画图工具（一般选择散点图），Inspect界面会自动弹出，对几 个常用选项进行设定：将散点图选中（用鼠标点击散点图边框才能 够选中图形），将AnalAcqCou・」（5） FSC和SSC 一般用线性（Lin），激光通道（FL1-FL4）—般用对数（Log）。

6） 调出细胞计数器：4. 上阴性对照将阴性对照管混匀，上机，功能键设置在“ RUN”，散点图出现细胞信号,第一个图：让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域；其他三个散点图,要将细胞信号调整到阴性区域,即左下角区域通过移动通道电压来实现Acq获取实验数据：暂停刚才实验pau 一 Ab注意：在获取细胞之前，要将Se tup前面的勾子取消5.上单阳管，调节功能键“ RUN”，如果细胞信号出现在双阳区域，说明有细胞信号露到相邻通道中，要将细胞信号调节到单一通道中 通过移动通道补偿来实现，想要细胞信号向哪个通道移动，就用散 点图中的另一个通道去减，即想要移动的那个通道作为减数如在FL1和FL2两个通道组成的散点图中，细胞信号出现在双阳区域，要 将细胞信号移动到FL1通道，就要调节FL2-FL1对应的补偿，直到 细胞信号只出现在FL1通道中，这样可以消除漏到FL2通道中的信 号备注：FL1-FITC，FL2-PE，FL3-PerCP，FL4-APC根据实验要求选择流速，按设置顺序上样6. 点击“ Acquire”命令，仪器开始获取数据，并自动将数据文件保存 到规定的目录下7. 样本获取完毕，功能键设置在“STANDBY”，并选择“脱机”命令。

8. 点击“Quit”命令，退出CellQuest软件9. 关机：（1）1% 次氯酸，高速（Hi） “RUN” 5-10 min，Acquire 如 果细胞计算器中不显示有细胞则表示管道已经干净2）用双蒸水高速（Hi） “RUN” 5-10 min，Standby 5 min，关 机四、DNA倍性分析实验：一、仪器情况检测，DNA倍性分析的质控用CellQuest Pro软件进行1. （1）保证机器预热5 min，打开CellQuest Pro软件，选择“联机”Acq —iConnect^H.做质控时，需要画三个图，第一个是散Four点图，横坐标是FSC,纵坐标是SSC；第二个 是散点图，横坐标是 FL2-Width，纵坐标是 FL2-Area ；第三个是直方图，横坐标是FL2-Area,纵坐标是Counter做DNA倍性实 验时一般使用PI染色，所以选择用第二通道(FL2)DNA倍性分析不需要调节补偿因为 属于单色实验，所以把电压界面 前的勾去掉将信号接收方式"Log”改为“Lin”, DDM Pram改为"FL2” 阈值使 用FL2,而不是FSC去掉细胞群中粘连体，上样本，利用第 二个图，调节FL2-A和FL2-W电压，使细胞群 信号显示在横纵坐标200 位置,通常血细胞中单 细胞成45°C，粘连体体积会比单细胞大，大概 在横坐标400位置。

保存质控二、DNA倍性分析用ModFit LT软件进行1) 打开ModFit LT软件，调出样品检测结果，(2) 选择面积(FL2-A)，选定 X 轴：FL2-W，Y 轴：FL2-A3)可以点击Auto选项，进行结果自动分析，也可以选择Manuale，人工分析FACSCalibur每日开机程序1・检查鞘液桶，确认：❖ 鞘液充满状态（~3升）❖ 盖紧黑盖❖ 管路畅通，无扭曲2. 检查废液桶，确认：❖ 废液桶充满100ml漂白剂❖ 管路畅通，无扭曲3. 打开流式细胞仪4. 打开电脑5. 气压阀置于加压位置，并排除管路中气泡6. 做 Prime7. 等待机器预热5-一10分钟后可开始实验FACSCalibur每日关机程序1. 用2mll0%稀释漂白剂（有效氯0・5-1%）作样品，将样品支撑架置 于旁位，以外管吸入lml2. 将样品支撑架置于中位，以HI RUN 5分钟3. 将样品换成蒸馏水重复1-2步，时间加倍4. 放置盛有1ml蒸馏水的试管于样品支撑架上5. 选择Standby模式5分钟后可关掉主机6. 退出所有应用软件，在关掉主机之前关闭电脑。