常用的基本操作技术.doc

常用的基本操作技术（一）消毒和灭菌技术 消毒（disinfection）与灭菌（sterilization）两者的意义有所不同消毒一般是指利用物理或化学方法消灭病原菌或有害微生物的营养体，而灭菌则是指利用强烈的物理或化学方法杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子但日常生活中两者常常通用灭菌的方法很多，一般可分为物理灭菌和化学灭菌两大类1. 物理灭菌 物理灭菌是最常用的灭菌方法主要包括热力学灭菌、过滤除菌和紫外线灭菌等1）热力学灭菌 又可分为干热灭菌和湿热灭菌两大类①干热灭菌 干热灭菌是利用高温使微生物的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的细胞内的蛋白质的凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快；含水量越小，凝固减慢因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度更高（160~170℃），时间更长（1~2h）进行干热灭菌时最高温度不能超过180℃，否则，包扎器皿的纸或棉塞就会被烤焦，甚至引起燃烧通常所说的干热灭菌是指利用干燥箱（或称烘箱）进行灭菌，主要用于玻璃器皿如培养皿、移液管和接种工具等的灭菌灭菌时将被灭菌的物体用双层报纸包好或装入特制的灭菌筒内，装入箱中，不要摆的太挤，以免妨碍热空气流通。

逐渐加温，使温度上升至160～170℃后保持2h灭菌结束后，切断电源，自然降温，待箱内温度降至70℃以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品注意在温度降至70℃以前切勿打开箱门，以免玻璃器皿炸裂另外，灼烧灭菌也属于干热灭菌在进行无菌操作时，接种工具如接种环、接种钩、接种铲、镊子等要在酒精灯火焰上充分灼烧，试管口、菌种瓶口在火焰上作短暂灼烧灭菌等②湿热灭菌 a.高压蒸汽灭菌 此法是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾产生蒸气待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性达到灭菌的目的在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大，三是湿热的蒸汽有潜热存在1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ的热量这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力在使用高压蒸汽灭菌锅时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。

一般培养基用0.11MPa，121℃，20～30min可达到彻底灭菌的目的 这种灭菌适用于培养基、工作服、橡胶制品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌b.常压蒸汽灭菌法 在不具备高压蒸汽灭菌的情况下，常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌方法对于不易用高压灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，也可用普通蒸汽笼进行灭菌由于常压，其温度不超过100℃，仅能使大多数微生物被杀死，而芽孢细菌却不能在短时间内杀死，因此可采用间歇灭以杀死芽孢细菌，达到彻底灭菌的目的常压间歇灭菌是将灭菌培养基放入灭菌器内，每天加热100℃，30min，连续3d，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物取出放室温下18~24h，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热100℃，30min，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌c.煮沸消毒法 注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法一般微生物学实验室中煮沸消毒时间为10～15min，可以杀死细菌所有营养体和部分芽孢如延长煮沸时间，并加入1%碳酸氢钠或2%～5%石炭酸，效果更好人用注射器和手术器械均采用高压蒸汽灭菌或干热灭菌，或采用一次性无菌用品。

d.超高温杀菌 超高温杀菌(ultra high temperature sterilization，简称UHTS)是指在温度和时间标准分别为130～150℃和2～8s的条件下对牛乳或其他液态食品(如果汁及果汁饮料、豆乳、茶、酒及矿泉水等)进行处理的一种工艺，其最大优点是既能杀死产品中的微生物，又能较好地保持食品品质与营养价值超高温杀菌工艺地应用，使乳制品及各种饮料等无需冷藏的理想变成了现实从而打破了地域和季节地限制超高温杀菌是自80年代以来已在世界各国广泛应用我国改革开放以来，超高温杀菌也广泛应用于橘子汁、猕猴桃汁、荔枝汁、菊花茶、牛乳等生产2）过滤除菌 许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热灭菌消毒灭菌方法，均会被热破坏，因此可以采用过滤除菌方法应用最广泛的过滤器有：①蔡氏(Seitz)过滤器 该滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属(银或铝)漏斗组成，分上、下两节，过滤时，用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液置于滤器中抽滤每次过滤必须用一张新滤板根据其孔径大小滤板分为三种型号：K型最大，作一般澄清用；EK滤孔较小，用来除去一般细菌；EK-S滤孔最小，可阻止大病毒通过，使用时可根据需要选用。

②微孔滤膜过滤器 这是一种新型过滤器，其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的薄膜孔径分0.025，0.05，0.10，0.20，0.30，0.45，0.60，0.80，1.00，2.00，3.00，5.00，7.00，8.00和10.00μm过滤时，液体和小分子物质通过，细菌则被截留在滤膜上实验室中用于除菌的滤膜孔径一般为0.22μm，但若要将病毒除掉，则需要更小孔径的微孔滤膜微孔滤膜不仅可以用于除菌，还可以用来测定液体或气体中的微生物，如水的微生物检查过滤除菌法应用十分广泛，除实验室用于某些溶液，试剂的除菌外，在微生物工业上所用的大量无菌空气及微生物工作使用的净化工作台，都是根据过滤除菌的原理设计的3）辐射灭菌 紫外线波长在200～300nm，具有杀菌作用，其中以265～266nm杀菌力最强此波长的紫外线易被细胞中核酸吸收，造成细胞损伤而杀菌，紫外线灭菌在微生物工作及生产实践中应用较广，无菌室或无菌接种箱空气可用紫外线灯照射灭菌此外，采用60Co-γ射线灭菌也已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜，各种积层材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌γ射线灭菌的最大优点是：穿透力强，可在厚包装完好条件下灭菌。

2.化学灭菌化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂，如重金属离子等，只是阻抑细菌代谢机能；细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂，如磺胺类及大多数抗生素等化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学药品浓度的高低，处理微生物的时间长短，微生物的种类以及微生物所处的环境等有关微生物实验室中常用的化学药品有2%煤酚皂溶液（来苏尔），0.25%新洁尔灭，0.1%升汞，3%~5%的甲醛溶液，75%乙醇溶液等常用化学杀菌剂的配制见附录四消毒与灭菌不仅是从事微生物学和整个生命科学研究必不可少的重要环节和实用技术，而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要的应用价值根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法 （二）无菌操作技术在微生物的分离和培养过程中，必须使用无菌操作技术所谓无菌操作技术，就是在分离、接种、移植等各个操作环节中，必须保证在操作过程中杜绝外界环境中的杂菌进入培养的容器或系统内，避免污染培养物无菌操作技术广泛应用于微生物、组织培养及基因工程等领域无菌操作技术，简单的说就是在无菌环境中进行的操作，为保证获得纯净的培养物，需要考虑各种因素的影响。

无菌操作过程各个环节见下图：   （1）培养基灭菌一般采用高压灭菌，将培养基放在高压锅中，排净冷空气后，在121℃灭菌20～30min，保证培养基处于无菌状态2）创造无菌接种环境无菌操作必须在无菌条件下进行常见的无菌场所有净化工作台、接种箱和接种室在进行操作前需将灭菌后的培养基以及接种用的酒精灯、工具等，放到接种场所，然后采用物理或化学方法进行环境处理①净化工作台 操作前用75％的酒精棉球擦拭台面，然后打开紫外线灯照射消毒，并打开风机吹20～30min，将台面上含有杂菌的空气排除，保持台面处于无菌状态②接种箱 操作前按照每m3空间用10～14ml甲醛和5～10g高锰酸钾进行混合熏蒸，熏蒸时间不少于30min或用市售气雾消毒剂进行熏蒸，每m3空间用4～5g接种箱中如有紫外线灯时，同时打开③接种室 灭菌方法同接种箱为避免药害，接种前可以喷洒甲醛用量1/2的氨水来中和残留的甲醛3）手消毒 先用肥皂水洗手，再用75％的酒精棉球擦拭手表面4）工具灭菌 点燃酒精灯，将接种工具在酒精灯外焰上充分灼烧，杀死工具表面附着的杂菌工具灭菌后不得再接触台面5）无菌操作（以转管为例） 左手拿一支母种和一支空白PDA培养基，右手拿灭菌后的接种构，将两个棉塞同时拔掉，夹在右手的无名指和小拇指、小拇指和掌根之间，不可将棉塞放到台面上。

拔掉棉塞后，试管口要在酒精灯火焰上方3～5cm处，利用火焰封口，然后用接种构切取少量母种，迅速通过酒精灯火焰，放到空白培养基斜面中央，轻压以防止滑动最后塞好棉塞6）培养 将接种后的菌种放到适宜的环境条件下培养培养环境要注意消毒，防止培养过程中杂菌侵染菌种7）检查 培养过程中要经常检查菌丝生长情况，发现有杂菌污染的菌种要及时挑出在进行微生物分离纯化以及其它无菌操作时，要有责任心，培养自己的无菌意识，加强训练，提高熟练程度，降低污染率三）菌种保藏技术微生物菌种是宝贵的生物资源，对微生物学研究和微生物资源开发与利用具有非常重要的价值，因此菌种保藏是一项重要的微生物学基础工作，其基本任务是对已经获得的纯种微生物菌种进行收集、整理、鉴定、评价、保存和供应等工作，随着科技的进步和经济的发展，对微生物菌种资源的利用正在不断地扩大，菌种保藏工作便显得更加重要菌种是一个国家的重要生物资源，也是许多微生物工厂首要的生产资料所以世界各国对微生物菌种的保藏都很重视，许多国家都成立了专门的菌种保藏机构如美国典型培养物保藏中心（ATCC）和美国农业部菌种保藏中心（ARS），我国主要有中国典型培养物保藏中心（CTCCCAS）和中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）等。

1. 菌种保藏的目的（1）在较长时间内保持菌种的生活能力2）保持菌种在遗传、形态和生理上的稳定性，使菌种保持既有科学研究的价值，又有工业价值的特征3）保持菌种的纯度，使其免受其它微生物（包括病毒）的侵染2. 菌种保藏的原理菌种保藏的原理是采用低温、干燥、饥饿、缺氧等手段，降低微生物的新陈代谢，抑制其生命活动，使其处于休眠状态3. 菌种保藏的方法采用低温、干燥、饥饿、缺氧等手段可以降低微生物的生物代谢能力，所以，菌种保藏的方法虽多，但都是根据这4个因素确定的下列方法可根据实验室具体条件和微生物的特性灵活选用1）斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待微生物菌种充分生长后，用报纸或牛皮纸包扎好，贴好标签，移至1～5℃的冰箱中保藏保藏时间依微生物的种类而有不同丝状真菌、放线菌以及有芽孢的细菌间隔4～6个月转接1次，酵母菌2个月，细菌最好每月转接1次此法是实验室和工厂菌种室常用的保藏法优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备缺点是长期保藏时需要多次转接，容易退化变异同时，多次转接污染杂菌的机会也会增加1培养基选择 保藏细菌时多用牛肉膏—蛋白胨培养基，保藏放线菌时。