细胞工程花药和花粉培养.ppt

第7章￿花药和花粉培养主要内容主要内容￿7.1   花药培养￿7.2   花粉培养￿7.3   花药和花粉培养中的白化苗问题￿7.4   操作实例植物花植物花药/花粉培养花粉培养历史史￿ Guha和Maheshwari （1964） 曼陀罗花药培养 ￿Nitsch 和 Norreel (1973) 烟草花粉培养（游离小孢子培养）￿ Chu（1973）小麦花粉培养 （早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体，能自 发形成胚胎发生的基因频率较低，效率极低）￿ ￿80年代后期到90年代期间，花培技术迅速发展许多作物小孢子 培养已经成功十字花科、麦类、水稻、玉米等￿ 90年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相续 成功Konzak (1999) 花粉和花花粉和花药的区的区别￿两者的异同点￿1.培养目的相同，均获得小孢子植株2.花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培3.花粉培养没有药壁组织干扰，可计数小孢子产胚率；能观察雄核发育的全过程，单倍体产量高但技术更复杂花粉和花花粉和花药的培养作用的培养作用￿1、作物育种 ￿（1）缩短育种周期：常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。

供体植株 小孢子（n）花粉植 株（n）加倍 纯合植株DH （2n）花培 雄核发育自然加倍人工一年内获得纯系￿（2）提高了目标基因型的选择效率 ￿例子：￿二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株￿￿常规方法：￿AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb 与Aabb区分开ABAbaBabABAABBAABbAaBBAaBbAbAABbAAbbAaBbAabbaBAaBBAaBbaaBbaaBbabAaBbAabbaaBbaabb￿（3）诱变育种中的作用￿植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及￿时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系 花药离体培养的过程： 7.1 花花药培养培养￿花药培养：是指把发育到一定阶段的花药接种在适宜培养基上，使其中的花粉发育成单倍体植株的过程￿花药培养过程的主要环节：1、选取花粉单核期的花蕾和幼穗；2、进行适当的预处理；3、对外植体进行表面消毒；4、无菌条件下取出花药接种到合适的培养基上，在适宜的条件下培养；5、花粉胚或花粉愈伤组织发育到适宜阶段后，转入植株再生培养基形成花粉植株；6、在试管苗阶段或移栽成活以后进行花粉植株的染色体加倍；7、炼苗，移入土壤栽培。

一、材料的一、材料的选择￿花药外植体的选择是否合适，直接关系到培养能否功1.供体植株的基因型材料的遗传背景对花药培养的影响很大，不同植物甚至不同品种之间对花药培养的反应都有差异，因此选择合适的品种常是培养能否成功的关键因素如水稻中粳稻比籼稻容易培养2.供体植株的生理状态供体植物生理对诱导频率有直接影响如多年生植物中，幼年植物比老龄植物的花药诱导频率高；草本植物中生长健壮的花药诱导频率较高；烟草开花早期的花药比后期的更容易产生花粉植株；供体植株的生长条件对花粉发育及其对离体培养的反应也有重要影响3.花粉的发育时期不同植物的花粉对离体培养有其特定的最敏感发育时期，因此，选择发育到合适时期的花粉是提高花粉植株诱导频率的重要因素例如烟草和水稻的花粉从单核早期至双核期都可接受诱导；小麦和玉米处于单核期的花粉培养效果最好；而天竺葵则从四分体的花粉得到最佳效果对于大多数植物来说，单核期的花粉比较容易培养发育时期物种减数分裂时期草莓、番茄种四分孢子期葡萄单核早中期石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯单核晚期荔枝、茄子、青椒、小麦单核早期至晚期烟草单核早期至双核期梨、水稻、甘蓝四分孢子期至双核期玉米不同物种不同物种诱导胚胎胚胎发生的最佳小生的最佳小孢子子发育育时期期检查花粉的发育时期的方法：染色法：如用醋酸洋红等染色制片，然后在显微镜下观察。

水稻单核靠边期￿鉴定二、二、预处理理￿在花药接种之前，先对其进行预处理可以提高诱导率￿预处理方法：1.低温预处理：一般可将带有叶鞘的穗子（如稻、麦类）或花蕾（如烟草、油菜等）用纱布包裹后再用塑料袋套起，放在冰箱中预处理2.高温预培养：在花药分离后，把培养物放置在较高温度条件下培养一段时间，然后再转移到常温条件下继续培养3.甘露醇预处理将大麦的花药用过滤除菌的0.3mol/L甘露醇溶液预培养3-5天，然后转移到过滤除菌的FHG液体培养基上漂浮培养，其中的小孢子散落到培养液中形成大量的花粉胚4.其他方法：离心预处理、乙烯利预处理、PEG预处理及磁场预处理三、培养基三、培养基￿培养基的组成对花药培养的成功率有明显的影响1.植物生长物质：不同植物甚至不同品种之间对生长物质的需求都有可能不同2.碳源：大部分培养基中使用的碳源都是以蔗糖来提供的，同时它还起着调节培养基渗透势的作用，不同植物及不同培养阶段对蔗糖浓度的要求不同3.其他成分：基本培养基中各无机成分对花药的离体培养中愈伤组织的产生有较大的影响四、培养方式四、培养方式1.液体培养优点：￿可以用过滤法除菌，其中生物活性物质不会因常规的高压灭菌而破坏，因此比在琼脂培养基上培养效果更好。

缺点:液体培养容易造成培养物通气不良，特别是随着愈伤组织重量的增加，容易沉到培养基底部，由于供养较差，可能会对愈伤组织的分化能力产生严重的影响2.双层培养：固体-液体双层培养基制作的方法是先在35mm×10mm的小培养皿中铺1-1.5mL琼脂培养基，待固化后在其表面再加0.5mL液体培养基，然后将花药接种在液体培养基中进行培养双层培养的优点是花药在培养早期可以从活性高的液体培养基汲取营养，花粉胚长大后不会沉没可以在通气良好的条件下分化成植株3.花药-花粉分步培养：先将花药接种在液体培养基（含Ficoll）上进行漂浮培养，花粉可以从花药中自然释放出来，散落在液体培养基中及时用吸管将花粉从液体培养基中取出，植板于琼脂培养基上，使其处于良好的通气环境中，可使花粉植株的诱导率大大的提高4.条件培养利用条件培养基，即预先培养过花药的液体培养基进行花药培养，可使花药培养效率大大提高五、培养条件五、培养条件1.温度：离体花药对温度的敏感性比较高2光照：不同植物对光照的要求不同六、花粉植株的倍性及染色加倍六、花粉植株的倍性及染色加倍l花药植株的倍性：花药培养中，由花粉发育成的花粉植株并不像所期望的那样全是单倍体，其中不但有二倍体还有多倍体和非整倍体。

花粉植株中出现自然加倍主要是由于核内有丝分裂造成的，核内有丝分裂与接种花粉的时期、培养基中植物生长物质的种类和水平、花粉植株的发生方式及愈伤组织继代培养时间的长短有直接关系l倍性鉴定的方法有：1、染色体直接计数法￿通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体￿数目￿2、间接鉴定￿（1）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪）￿主要测定叶片单个细胞￿中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm²￿（2）细胞形态学鉴定法单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性￿（3）植株形态学鉴定法￿￿￿￿￿叶片保卫细胞大小、单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头￿长，花粉粒小，不结实（4）杂交鉴定法￿自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞5）分子标记鉴定包括生化标记（如同工酶标记）和分子标记（如RFLP、RAPD、AFLP等）l染色体加倍单倍体植株不能正常结实，只有经过染色体加倍、育性才能恢复，而且在遗传上是纯合的，为了获得更多的二倍体植株，除了有意识的利用上述自发的核内有丝分裂产生二倍体外，还需要通过人工方法使单倍体植株染色体加倍，成为纯合二倍体。

l染色体加倍（一）茎段培养将单倍体植株的茎段进行培养，诱导愈伤组织形成由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定频率的￿核内有丝分裂，从而形成二倍体细胞，分化出纯合的二倍体植株二）化学试剂诱变￿￿￿有秋水仙素、Oryzalin、trifluralin、APM等1、秋水仙素诱导￿（1）浸泡法￿￿￿￿无菌条件下以一定浓度的秋水仙素浸泡再生小植株，再转移至新鲜培养基中培养￿（2）生长锥处理￿￿￿￿￿秋水仙素水溶液直接涂抹生长点（顶芽或腋芽）￿（3）培养基处理￿￿￿￿将单倍体植株和任何一部分作为外植体，种植在附加一定浓度和秋水仙素的培养基中培养一段时间后，转入无秋水仙￿素的相同培养基中继续培养诱导胚状体￿2、除草剂诱导￿（毒性小，引起植株的变异几率小）水稻花水稻花药栽培栽培水稻花水稻花药栽培栽培7.2 花粉培养花粉培养￿花粉培养：即小孢子培养，是将花粉粒从花药中分离出来进行培养技术，花粉培养和花药培养一样都是获得植物单倍体的有效方法一、材料的一、材料的选择和和预处理理￿和花药培养类似，供体植株的基因型和栽培条件、花粉的发育时期和预处理等，对花粉培养能否成功有着重要的影响￿影响因素：1.不同植物及同一植物不同基因型材料在同样的实验条件下，花粉培养的诱导频率差异很大。

2.供体植物的生理状态对花粉的胚胎发生也有很大的影响一般从发育健壮的植株上取花粉进行培养效果较好3.花粉培养还受供体植株生长条件的影响，如温度、光照等因素选择合适的花粉发育时期是提高植株花粉诱导频率的重要因素不同作物适宜的花粉发育时期不同l和花药培养一样，适当的预处理可以提高花粉培养的成功率二、花粉的分离二、花粉的分离￿所得花粉需满足以下条件：1.花粉的成活率较高￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿2.发育整齐3.要达到一定数量                               4.无菌、无杂质￿分离的方法有：￿1.挤压法￿￿      2.散落法￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿3.器械法￿￿￿￿￿￿￿（1）小型搅拌器￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿（2）超速旋切机如果需要，可以把以上三种方法分离所得的花粉进一步用密度梯度离心纯化二、花粉的培养方法二、花粉的培养方法￿1.培养基和花药培养类似，花粉培养中多使用过滤除菌液体培养基，其中的铵态氮浓度一般比较低，通常加入一些有机氮源一般情况下，对于花粉胚状体发生所需的植物生长物质，不同种类、浓度效果不同，不同供体材料的反应也不一致。

二、花粉的培养方法二、花粉的培养方法￿2.培养方法7.2 花花药和花粉培养中的白化苗和花粉培养中的白化苗问题植株白化苗植株白化苗现象象一、白化苗一、白化苗产生的因素生的因素￿1.外因1）光照条件的影响         2） 温度条件的影响           3）其他环境因素的影响2.内因1）叶绿素等光合色素合成酶基因的突变2）质体分化和叶绿体发育相关基因突变3）其他内源因素一些非光合系统蛋白的编码基因突变、叶绿体蛋白转运受阻和核-基质组之间的相互作用及不亲和性都可能引起百花现象的发生二、白化苗的控制二、白化苗的控制￿通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控二、白化苗的控制二、白化苗的控制￿通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控二、白化苗的控制二、白化苗的控制￿通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控三、植物白化苗三、植物白化苗发展及研究状况展及研究状况￿近年来，随着理论研究的不断深入以及各种研究手段的不断发展，白化突变体的利用价值受到越来越多的关注￿尽管有关植物白化苗发生机智的研究取得了一定的进展，但在这一领域中仍有很多问题尚待解决。

7.4、操作、操作实例例￿对烟草花药和花粉的培养（教材P88）。