大肠埃希菌检查.docx

实训一大肠埃希菌的检查一、 实训目标1. 熟悉药品中大肠埃希菌的检验原理2. 掌握由口服药品中分离鉴定大肠埃希菌的程序及步骤3. 学会分析检验结果，识别大肠埃希菌的特征4. 掌握检验数据的处理，能够规范书写检验原始记录及检验报告书二、 实训原理大肠埃希菌是肠道中存在的正常菌群，故常来源于人和动物的粪便，所以常 作为粪便污染的指标一旦被检药物中查出大肠埃希菌，表明该药品已被粪便污 染，可能存在肠道致病菌和寄生虫卵，患者服用该药物后有引起感染的危险因 此，大肠埃希菌被列为重要的卫生指标菌国家药品卫生标准规定口服药品不得 检出大肠埃希菌中国药典采用了 MUG—Indole快速测定药品中大肠埃希菌在MUG试验中，将MUG （4-甲基伞形酮葡糖苷酸）作为目标菌的基本营养物 加入培养基中，被大肠埃希菌的0-葡萄糖醛酸酶直接分解产物又作为一种指示 系统，在366 nm紫外光下呈现兰白色荧光，即MUG阳性；若无荧光，即MUG阴 性靛基质（Indole）试验中，大肠埃希菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚 吲哚的存在可用显色反应表现出来吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲 哚，为红色化合物因此根据大肠埃希菌的这一性质，对MUG呈阳性者，再加对-甲氨基苯甲醛 试剂数滴，轻摇试管，培养液上层呈现玫瑰红色者（阳性），报告检出大肠埃希菌。

如果两者都为阴性，报告未检出大肠埃希菌如果一阴一阳，需要进一步的培养 和生化试验检查本方法对大肠埃希菌的检出率达98%培养温度：控制菌培养温度为30〜35°C三、 实训步骤（一）实训用设备、仪器与试药的准备100ml量筒、10ml吸量管、500ml烧杯、250ml锥形瓶、150ml锥形瓶、玻 棒、大试管、6cm培养皿、吸耳球、小试管、1ml吸量管乳糖胆盐培养基、MUG培养基、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、蛋白胨、 1.0mol/lHCl溶液、1.0mol/lNa0H溶液、EMB、对二甲氨基苯甲醛、戊醇、盐酸 稀释液与培养基的配制1） PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 （200ml/2组）磷酸二氢钾0.7g 磷酸氢二钠1.5g 氯化钠0.9g蛋白胨0.2g 蒸馏水200ml配制：取上述成分混合，溶解，分装锥形瓶2个（用150ml锥形瓶），约90ml/ 个，包扎，标记，12115min灭菌乳糖胆盐培养基 （400ml/2组）2）乳糖胆盐培养基12g 蒸馏水400 ml PH=7.6配制：称取，溶解，调节PH值，分装锥形瓶4个（用250ml锥形瓶），约 100ml/个，包扎，标记，11515min灭菌（二）实验用仪器的包扎（以组为单位） lml吸量管2支、50ml烧杯1个、 10ml吸量管2支（（三）大肠埃希菌检查法一一常规平板法检查1、 供试液的稀释用吸量管吸取葡萄糖酸钙口服药液10ml，到装有90ml pH7.0氯化钠-蛋白胨 缓冲液的锥形瓶中，混匀，得到1： 10的供试液。

2、 阳性对照试验取1 ： 10供试液10ml和1ml含菌量10〜100cfu的大肠埃希菌菌悬液加入增菌 培养基，按大肠埃希菌检查法检查，作为阳性对照，应別UG阳性、靛基质阳性， 检出大肠埃希菌3、 增菌培养取1 ： 10供试液10ml （相当于供试品1g）接种于BL增菌培养基，培养18〜 24小时4、 MUG培养各 取上述培养物0.2ml，分别接种到两支5mlMUG培养基的试管内，培养， 于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基做本底 对照然后沿管壁加靛基质试液数滴观察5、 分离培养 （教师做阳性板给学生看大肠埃希菌的菌落形态）用接种环沾取需进一步检查的培养物划线接种于EMB平板上，培养18〜24h 检查有无疑似大肠埃希菌菌落，若无，判供试品未检出大肠埃希菌；若有，进一 步做以下试验6、 结果分析1） MUG、靛基质结果判断MUG培养结果：在366nm紫外线下观察靛基质结果：液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试液本色，为靛基质阴性 MUG阳性、靛基质阳性，判检出大肠杆菌；MUG阴性、靛基质阴性，判未检出大肠杆菌；MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性，需进一步做以下检查2） EMB培养结果判断EMB培养18-24h后，检查有无疑似大肠埃希菌菌落（大肠埃希菌落形态特 征见表），若无，判供试品未检出大肠埃希菌；若有，进一步做以下试验大肠埃 希菌落形态特征大肠埃希菌菌落形态特征培养基菌落形态EMB呈紫黑色、浅紫色、篮紫色或粉红色，菌落中心呈深紫 色或无明显暗色中心，圆形，微突起，边缘整齐，表面光滑， 湿润，常有金属光泽3）结果记录30〜35°C培养项目供试品阳性对照MUG靛基质结果:□未检出/g (ml)□检出/g (ml)个。

霉菌及酵母菌口服制剂细菌数g不得超过1000个；1ml不得超过100个 数1g不得超过100个控制菌1g（1ml）不得检出大肠埃希菌结论：本品按2010年版《中国药典》二部附录XI J微生物限度检查法检查, 结果：四、 注意事项1. 实训过程要严格无菌操作2•供试液稀释及注入培养皿时应摇匀再取，供试液从制备至加入培养基不 得超过1h3.掌握好培养基的倒入温度，不宜太高或太低4•平板要倒置培养，掌握培养温度与培养时间5. 计数菌落可用放大镜检查，以防漏数若平板上有片状、花斑状菌落或 蔓延生长成片，该平板无效6. 配制MUG培养基时，务必调pH，否则pH偏高，MUG分解，本身则 显荧光7. 若营养琼脂培养基中生长的真菌菌落数多于玫瑰红钠琼脂培养基中的真 菌菌落数，或玫瑰红钠琼脂培养基中生长的细菌菌落数多于营养琼脂培养基中的 细菌菌落数，以菌落数多的培养基中的菌数报告结果五、 思考题1. 为什么要以大肠埃希菌作为药物、水、饮料、食品等的卫生学指标菌？2. 为什么要做微生物限度检查的验证试验？。