基因重组和基因工程ppt课件.ppt

基因重组和基因工基因重组和基因工程程(ppt)优选基因重组和基因工程优选基因重组和基因工程自然界自然界DNADNA重组和基因转移是经常重组和基因转移是经常发生的发生的 DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature第一节第一节什么是什么是DNA重组？重组？DNA分子内或分子分子内或分子间发生生遗传信息的重新信息的重新组合 DNA DNA片段在片段在细胞内、胞内、细胞胞间，甚至在不同物，甚至在不同物种之种之间进行交行交换，交，交换后的片段仍然具有复制和后的片段仍然具有复制和表达的功能表达的功能 DNA重重组广泛存在于各广泛存在于各类生物：生物：真核生物基因组间重组多发生在减数分裂时同真核生物基因组间重组多发生在减数分裂时同源染色体之间的交换源染色体之间的交换原核生物来自不同亲代两组原核生物来自不同亲代两组DNADNA之间可通过多种之间可通过多种形式遗传重组形式遗传重组 意意义：迅速增加群体：迅速增加群体遗传多多样性、区分有利、不利突性、区分有利、不利突变、、 通通过优化化组合合积累有意累有意义的的遗传信息信息 参与参与许多重要的生物学多重要的生物学过程程DNADNA重组的分类重组的分类重组的分类重组的分类转 座座 (transposition)同源重同源重组 (homologous recombination)位点特异的重位点特异的重组(site-specific recombination)概概念念：：发发生生在在同同源源序序列列间间的的重重组组，，通通过过链链的的断断裂裂（（,配配对对））和和再再连连接接，，在在两两个个DNA分分子子同同源源序列间进行单链或双链片段交换的过程。

序列间进行单链或双链片段交换的过程又称基本重又称基本重组（（general recombination)是最基本的是最基本的DNA重重组方式方式一、同源重组是最基本的一、同源重组是最基本的DNA重组方式重组方式指在同一物种不同个体指在同一物种不同个体指在同一物种不同个体指在同一物种不同个体间间或不同物种或不同物种或不同物种或不同物种间间相同或相同或相同或相同或相似的相似的相似的相似的DNADNA序列序列序列序列 同源重同源重组最初的最初的证据来自据来自细胞胞遗传学学对减数分裂减数分裂时染染色体行色体行为的研究真核生物在形成配子的研究真核生物在形成配子时，，细胞染色胞染色体体进行一次复制，行一次复制，细胞核胞核进行两次分裂，由此从双倍行两次分裂，由此从双倍体体细胞胞产生生单倍体倍体细胞，故称减数分裂胞，故称减数分裂前期，参与前期，参与联会的同源染色体会的同源染色体实际上已复制形成两条上已复制形成两条姊妹染色体，从而出姊妹染色体，从而出现有四条染色体构成的四有四条染色体构成的四联体在四在四联体的某些位置非姊妹染色体的某些位置非姊妹染色单体之体之间可以可以发生交生交换n同源重组机制同源重组机制—Holliday模型模型（（1）两个同源染色体）两个同源染色体DNA排列整排列整齐（任意两个（任意两个同源同源DNA片断可以片断可以发生重生重组，但同源双，但同源双链DNA分子必分子必须紧密接触，方能交密接触，方能交换）。

ＡＡ ＢＢ ＣＣ ＡＡ′ B′ C′′ B′ C′ a′ b′ c′ a′ b′ c′ a b c a b c123 34 4 （（2）一个）一个DNA的一条的一条链断裂、并与另一个断裂、并与另一个DNA对应的的链连接接5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´（（3）通）通过分支移分支移动产生异源双生异源双链DNA，，形成形成Holliday中中间体体5´3´5´3´5´3´5´3´片段重组体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant) （（4））Holliday中间体切开并修复，形成两个中间体切开并修复，形成两个双链重组体双链重组体DNA，分别为：，分别为：5´3´5´5´5´3´3´3´ DNA连接酶连接酶片片段段重重组组体体5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC)5´3´5´5´5´3´3´3´拼拼接接重重组组体体5´5´5´5´3´3´3´3´5´3´5´5´5´3´3´3´ DNA连接酶连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´片段重组体片段重组体 （见模型图右边产物）：（见模型图右边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本本DNA。

拼接重组体（见模型图左边产物）：拼接重组体（见模型图左边产物）： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本链区的两侧来自不同亲本DNA 参与参与E.coli同源重组的主要酶同源重组的主要酶RecA蛋白：蛋白：结合合单链DNA，形成的复合物，复合，形成的复合物，复合物可将物可将同源双螺旋中的互同源双螺旋中的互同源双螺旋中的互同源双螺旋中的互补顺补顺序序序序“ “退火退火退火退火” ”，同，同，同，同时时将将将将另一条另一条另一条另一条链链排排排排挤挤出去，形成所出去，形成所出去，形成所出去，形成所谓谓D D环环RecBCD：具有三种：具有三种酶活性：活性：①①DNA解旋解旋酶；；②②核核酸外切酸外切酶；；③③单链内切内切酶的活性RuvC ：特异的：特异的识别Holliday分支点，并改分支点，并改变DNA在在Holliday分支点分支点处的构型，将两条的构型，将两条单链切断，随切断，随后由后由连接接酶将切口将切口连接接. 内切酶内切酶 (recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA) 内切酶内切酶(recBCD) DNA 连接酶连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体中间体5´3´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´3´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC) DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶片片段段重重组组体体拼拼接接重重组组体体①① 不需要特异不需要特异DNA序列，而是依序列，而是依赖两个分子两个分子间序列的相同或相似性（同源性）；序列的相同或相似性（同源性）；②② 同源双同源双链DNA分子必分子必须紧密接触，相密接触，相对应方方才能交才能交换（（联会）会）③③重重组时，两个，两个DNA片段必片段必须有一个有一个发生断裂或生断裂或有一段有一段单链缺失（空隙）。

缺失（空隙）同源重同源重组特点：特点：二、细菌的基因转移与重组有四种方式二、细菌的基因转移与重组有四种方式细菌可以通菌可以通过多种途径多种途径进行行细胞胞间基因基因转移，移，并通并通过基因重基因重组适适应随随时改改变的的环境这种种遗传信息的流信息的流动不不仅发生在种内，也生在种内，也发生生在种在种间如果被如果被转移基因与内在基因部分同源就可以移基因与内在基因部分同源就可以发生同源重生同源重组（一）接合作用（一）接合作用当当细细菌菌的的细细胞胞通通过过性性菌菌毛毛相相互互接接触触时时，，质质粒粒DNA从从一一个个细细胞胞转转移移至至另另一一细细胞胞的的过过程称为接合作用程称为接合作用(conjugation)细细菌染色体外的小型菌染色体外的小型菌染色体外的小型菌染色体外的小型环环状双状双状双状双链链DNADNA分子可自分子可自分子可自分子可自主复制主复制主复制主复制供体供体细胞被定胞被定义为雄性雄性受体受体细胞被定胞被定义为雌性雌性能够促使能够促使DNA转移的质粒称为致育因子，转移的质粒称为致育因子， F 因子因子(F factor) 与接合功能有关的蛋白质（性菌毛等）均与接合功能有关的蛋白质（性菌毛等）均由由F因子编码。

因子编码F质粒粒DNA可以通可以通过重重组整合到受体的染色体整合到受体的染色体中，使受体菌成中，使受体菌成为高高频重重组（（Hrf)菌株菌株若若F质粒的粒的DNA未能完整地未能完整地进入受体菌，入受体菌，则受受体菌不能体菌不能转化化为F+F质粒的粒的DNA可以被切割出来，有可以被切割出来，有时可携可携带宿宿主菌的染色体主菌的染色体DNA，称作，称作F΄因子，因子， F΄因子携因子携带的基因可在受体菌表达的基因可在受体菌表达（二）转化作用（二）转化作用通通过过自自动动获获取取或或人人为为地地供供给给外外源源DNA，，使使细细菌菌获获得得新新的的遗遗传传性性状状的的现现象象，，称为转化作用称为转化作用 (transformation)具有具有摄取周取周围环境中游离境中游离DNA分子能力的分子能力的细菌菌称称为感受感受态细胞胞很多很多细菌在自然条件下就有吸收外源菌在自然条件下就有吸收外源DNA的能的能力（如固氮菌、力（如固氮菌、链球菌等），球菌等），虽然感受然感受态经常常是瞬是瞬间的自然条件下感受自然条件下感受态的形成需要的形成需要10多种蛋白多种蛋白质参参与与实验室：高室：高浓度的度的Ca2+处理使理使细菌形成感受菌形成感受态①①.游离游离DNA与细胞表面与细胞表面DNA结合结合蛋白结合，蛋白结合，②②.其中一股链被核酸酶降解，另一其中一股链被核酸酶降解，另一股链被吸收股链被吸收（三）转导作用（三）转导作用当当病病毒毒从从被被感感染染的的（（供供体体））细细胞胞释释放放出出来来、、再再次次感感染染另另一一（（受受体体））细细胞胞时时，，发发生生在在供供体体细细胞胞与与受受体体细细胞胞之之间间的的DNA转转移移及基因重组即为转导作用及基因重组即为转导作用(transduction)。

通通过噬菌体（病毒）将噬菌体（病毒）将细菌（菌（细胞）基胞）基因从供体因从供体转移到受体移到受体λ噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径 (lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)　　　　转导过程（四）细胞融合（四）细胞融合细胞胞质膜融合膜融合导致基因致基因转移、重移、重组实验室：溶菌室：溶菌酶除除细菌菌细胞壁，人工促使原生胞壁，人工促使原生质体融合，引起广泛的重体融合，引起广泛的重组三、位点特异重组，即特异位点间三、位点特异重组，即特异位点间发生的整合发生的整合位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异序列的特异位点间发生的整合位点间发生的整合 原核生物中，有原核生物中，有时基因重基因重组依依赖于小范于小范围的同源的同源序列的序列的联会，重会，重组只限于只限于该小范小范围内，只涉及特定位内，只涉及特定位点的同源区，点的同源区，这类重重组称作～称作～ λ噬噬菌菌体体的的整整合合酶酶识识别别噬噬菌菌体体和和宿宿主主染染色色体体的的特特异异靶靶位位点点发发生生选选择择性性整整合合；；反反转转录录病病毒毒整整合合酶酶可可特特异异地地识识别别、、整整合合反反转转录录病病毒毒cDNA的的 长长 末末 端端 重重 复复 序序 列列 (long terminal repeat, LTR)。

（一）（一）λ噬菌体噬菌体DNA的整合的整合（二）细菌的特异位点重组（二）细菌的特异位点重组如果一个如果一个DNA分子上两个特异位点之分子上两个特异位点之间发生重生重组，其后果有两种可能性：即两个位点之，其后果有两种可能性：即两个位点之间的的节段或被段或被丢失，或被失，或被颠倒倘若基因重倘若基因重组发生在生在调节基因或基因基因或基因调控区，控区，就会影响某些基因的就会影响某些基因的“开关开关”机制有些生物机制有些生物能能够利用利用这种重种重组倒置来控制基因的表达倒置来控制基因的表达①①两端各有一个两端各有一个14bp的反向重复序列（特异重的反向重复序列（特异重组位点位点-hix），二者方向相反二者方向相反②②中中间是是hin基因，基因，编码特异的重特异的重组酶-倒位倒位酶，催，催化化H片段片段倒位重倒位重组③③ hin基因两端各有一个启基因两端各有一个启动子（子（P)，其中一个启，其中一个启动子启子启动hin基因表达基因表达产生倒位生倒位酶，另一个启，另一个启动子子正向启正向启动邻近的近的H2和和rH1基因表达，分基因表达，分别产生生H2鞭毛蛋白和鞭毛蛋白和H1阻遏蛋白阻遏蛋白阻抑蛋白可抑制阻抑蛋白可抑制远方方H1基因的表达。

因而基因的表达因而结果是果是H2表达而表达而H1不表达H片段的片段的组成和功能：成和功能：沙门菌沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变hix为为反反向向重重复复序序列列，，它它们们之之间间的的H片片段段可可在在Hin控控制制下下进进行行特特异异位位点点重重组组(倒倒位位)H片片段段上上有有两两个个启启动动子子P，，其其一一驱驱动动hin基基因因表表达达，，另另一一正正向向时时驱驱动动H2和和rH1基基因因表表达达，，反反向向(倒倒位位)时时H2和和rH1不不表表达达rH1为为H1的阻遏蛋白基因的阻遏蛋白基因 H2鞭毛素鞭毛素 阻遏蛋白阻遏蛋白Hin转位片段转位片段hinH2IH1 H1鞭毛素鞭毛素hinH2IDNA启动序列启动序列H1启动序列启动序列沙门菌沙门菌H H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变四、转座重组四、转座重组大多数基因在基因大多数基因在基因大多数基因在基因大多数基因在基因组组内的位置是固定的，内的位置是固定的，内的位置是固定的，内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移但有些基因可以从一个位置移但有些基因可以从一个位置移但有些基因可以从一个位置移动动到另一位到另一位到另一位到另一位置。

置这这些可移些可移些可移些可移动动的的的的DNADNADNADNA序列可以分序列可以分序列可以分序列可以分为为：插：插：插：插入序列和入序列和入序列和入序列和转转座子两座子两座子两座子两类类 由插入序列和由插入序列和转座子介座子介导的基因移位或重排称的基因移位或重排称为转座座(transposition)转转座子中包含一些基因，座子中包含一些基因，座子中包含一些基因，座子中包含一些基因，这这些基因可以使些基因可以使些基因可以使些基因可以使转转座座座座子从原来的子从原来的子从原来的子从原来的DNADNA链链位置上断裂开来，然后再插位置上断裂开来，然后再插位置上断裂开来，然后再插位置上断裂开来，然后再插入到另外的入到另外的入到另外的入到另外的DNADNA链链位置上当插入到一个新的位置上当插入到一个新的位置上当插入到一个新的位置上当插入到一个新的位置后，位置后，位置后，位置后，转转座子座子座子座子对对附近基因的功能会造成一定附近基因的功能会造成一定附近基因的功能会造成一定附近基因的功能会造成一定的影响，在离开的影响，在离开的影响，在离开的影响，在离开该该位置位置位置位置时时，它又有可能把一些，它又有可能把一些，它又有可能把一些，它又有可能把一些附近的基因也一起附近的基因也一起附近的基因也一起附近的基因也一起带带走。

走转转座子的座子的座子的座子的这这种行种行种行种行为为有有有有点点点点“ “唯我独尊唯我独尊唯我独尊唯我独尊” ”，是基因的自私性的一种表，是基因的自私性的一种表，是基因的自私性的一种表，是基因的自私性的一种表现现 插入序列插入序列(insertion sequences, IS)组成：组成：IRTransposase GeneIR（一）插入序列转座（一）插入序列转座二个分离的反向重复二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列序列一个转座酶（一个转座酶（transposase)编码基因编码基因插入序列发生转座的形式：插入序列发生转座的形式：保守性转座保守性转座(conservative transposition) 复制性转座复制性转座(duplicative transposition)当插入序列当插入序列转座座时，宿主靶部位双，宿主靶部位双链被交被交错切开，切开，经修复后形成短的正向重复修复后形成短的正向重复靶序列通常是任意的但交靶序列通常是任意的但交错切开的切开的长度是固度是固定的插插入入序序列列的的复复制制性性转转座座转座子转座子(transposons) —可从一个染色体位可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。

点转移到另一位点的分散重复序列IRIRTransposase Gene有用基因有用基因（二）转座子转座（二）转座子转座转座子组成：转座子组成： 反向重复序列反向重复序列转座酶编码基因转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因 细菌的可流动性元件细菌的可流动性元件A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示箭头所示)B转座子转座子Tn3：含有转座酶、：含有转座酶、β-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C转座子转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L由转座子介导的转座由转座子介导的转座第二第二节 重重组DNA技技术又称又称DNA克隆或分子克隆克隆或分子克隆DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。

的豌豆杂交试验1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的技术制造医学上重要的药物1980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂技术生产胰岛素的工厂1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉英国罗林研究所成功的克隆了多莉一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合贝的集合获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，，即无性繁殖即无性繁殖一）（一） DNA克隆克隆技术水平：分子克隆技术水平：分子克隆(molecular clone) （即（即DNA 克隆）克隆） 细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　个体克隆（动物或植物）　应应用用酶酶学学的的方方法法，，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质（（同同源源的的或或异异源源的的、、原原核核的的或或真真核核的的、、天天然然的的或或人人工工的的DNA））与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有 自自 我我 复复 制制 能能 力力 的的 DNA分分 子子 ——复复 制制 子子(replicon)，，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化子子细细胞胞，，再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNA分分子子，，也也称称基基因因克克隆隆或或重组重组DNA (recombinant DNA) 。

DNA克隆克隆生物技术工程生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等工程、细胞工程等 目的：目的：①① 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA ②② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering) —— 实现基因实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组又称重组DNA工艺学（二）工具酶（二）工具酶Ø 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶Ø DNA聚合酶聚合酶ⅠØ 逆转录酶逆转录酶Ø T4DNA连接酶连接酶Ø 碱性磷酸酶碱性磷酸酶Ø 末端转移酶末端转移酶Ø Taq DNA聚合酶聚合酶重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5´磷酸基和磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，羟基末端之间形成磷酸二酯键，使使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶Ⅰ①①合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接②②缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针③③DNA序列分析序列分析④④填补填补3´末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。

常用于外切活性常用于cDNA第二链第二链合成，双链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶①①合成合成cDNA②②替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3´羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 限限 制制 性性 核核 酸酸 内内 切切 酶酶 (restriction endonuclease, RE)是是识识别别DNA的的特特异异序序列列, 并并在在识别位点或其周围切割双链识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶的一类内切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HⅠ定义：定义：与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰饰系统，限制外源系统，限制外源DNA，保护自身，保护自身DNAⅠ、、Ⅱ、、Ⅲ（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用Ⅱ型）型）分类：分类：作用：作用：ⅡⅡ类酶识别序列特点类酶识别序列特点—— 回文结构回文结构(palindrome) 切口切口 ：平端切口：平端切口、、粘端切口粘端切口GGATCCGGATCCCCTAGGCCTAGGBam HⅠGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口来来源源不不同同的的限限制制酶酶，，但但能能识识别别和和切切割割同一位点，这些酶称同功异源酶。

同一位点，这些酶称同功异源酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+BstⅠ同功异源酶：同功异源酶：有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，，但但切切割割DNA后后，，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，，称称为为同同尾尾酶酶这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为为配配伍未端伍未端(compatible end)Bam Bam HⅠHⅠBg Bg lⅡlⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G++++ATCTAG GATCT A 同尾酶同尾酶名　　称　　 　识别序列及切割位点名　　称　　　　　识别序列及切割点切割后产生５’突出末端:BamHⅠ 5’…G▼GATCC...3’Bgl Ⅱ 5’…A▼GATCT...3’EcoR Ⅰ 5’…G▼AATTC...3’Hind Ⅲ 5’…A▼AGCTT...3’ Hpa Ⅱ 5’…C▼CGG...3’ Mbo Ⅰ 5’…▼GATC...3’ Nde Ⅰ 5’…GA▼TATG...3’切割后产生3’突出末端:Apa Ⅰ 5’…GGGCC▼C...3’Hae Ⅱ 5’…PuGCGC▼Py...3’Kpn Ⅰ 5’…GGTAC▼C...3’Pst Ⅰ 5’…CTGCA▼G...3’Sph Ⅰ 5’…GCATG▼C...3’切割后产生平末端:Alu Ⅰ 5’…AG▼CT...3’EcoR Ⅴ 5’…GAT▼ATC...3’Hae Ⅲ 5’…GG▼CC...3’Pvu Ⅱ 5’…CAG▼CTG...3’Sma Ⅰ 5’…CCC▼GGG...3’ 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶（三）目的基因（三）目的基因(target gene) ØcDNA (complementary DNA) 指经反转录合成的、与指经反转录合成的、与RNA (通常指通常指mRNA或病毒或病毒RNA)互补的单链互补的单链DNA。

以单链以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链为模板、经聚合反应可合成双链cDNA Ø基因组基因组DNA (genomic DNA) 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色染色体及线粒体体及线粒体)的所有的所有DNA序列 （四）基因载体（四）基因载体 定义定义为携带目的基因，实现其无性繁为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些一些DNA分子 常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意意设计的载体称为克隆载体设计的载体称为克隆载体表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体多肽链而特意设计的载体称为表达载体载体的选择标准：载体的选择标准：Ø能自主复制；能自主复制；Ø具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；筛选和鉴定；Ø有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；个单一酶切位点，称为多克隆位点；Ø分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。

1.1.质粒质粒 (plasmid)特特点点: : 能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；；带带有有某某些些遗传信息遗传信息, , 会赋予宿主细胞一些遗传性状会赋予宿主细胞一些遗传性状  λ噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 λgt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2.2.噬菌体噬菌体(phage) M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因） M13mp系列系列 pUC系列系列 酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）4.其他其他二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体细胞导入受体细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达  以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列物的氨基酸序列 。

基因基因组DNA文文库(genomic DNA library)cDNA文文库(cDNA library)聚合聚合酶链反反应(polymerase chain reaction, PCR) (见第见第22章章) 化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列组织或或细胞染色体胞染色体DNA基因片断基因片断克隆克隆载体体重重组DNA分子分子含重含重组分子的分子的转化菌化菌限制性内切限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos~20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库用随机切割的真核生物染色体用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库片段构建基因文库 mRNA cDNA 双双链cDNA 重重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反反转录酶 载体体 受体菌受体菌 复制复制 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶ⅠⅠ碱水解碱水解 T T T T（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建目的不同，操作基因的性质不同，目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。

载体的选择和改建方法也不同 （三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接配伍末端连接配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接1.粘性末端连接粘性末端连接Bam HⅠ切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15ºCGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam HⅠⅠ切割切割载体载体DNA用用Bam HⅠ切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同同一一限限制制酶酶切切位位点点连连接接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco RⅠ切割位点切割位点Bg lⅡ切割位点切割位点+ +EcoRⅠ+ Bg lⅡ双酶切双酶切Eco RⅠ+ Bg lⅡ双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15ºC重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似2.平端连接平端连接 限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：适用于：目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15ºC重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连在在末末端端转转移移酶酶(terminal transferase) 的的作作用用下下，，在在DNA片片段段末末端端加加上上同同聚聚物物序序列列、、制制造出粘性末端，再进行粘端连接。

造出粘性末端，再进行粘端连接3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接5´3´3´5´载体载体DNA5´3´3´5´目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5´3´ 3´5´ 5´ 3´ T(T)nT T(T)nT 3´5´ 5´ 3´ 3´5´3´ A(A)nA A(A)nA 3´5´λ-核酸外切酶核酸外切酶λ-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15ºC重组体重组体5´由平端加上新的酶切位点，再用限制由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接 4.人工接头人工接头(linker)连接连接人人工工接接头头及及其其应应用用CCGAATTCG GGCTTAAGC5´-3´-Eco RⅠEco RⅠEco RⅠEco RⅠ受体菌条件：受体菌条件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent) 导入方式：导入方式：转化转化 (transformation)转染转染 (transfection)感染感染 (infection)（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌1. 直接选择法直接选择法(1) 抗药性标记选择抗药性标记选择(2) 标志补救标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹2. 免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选1. 直接选择法直接选择法(1) 抗药性标记选择抗药性标记选择(2) 标志补救标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹2. 免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选( (插插入入失失活活法法) ) 抗抗药药性性标标记记选选择择 α互互补补利用利用α互补原理筛选重组体互补原理筛选重组体pUC18  原原位位杂杂交交 Southern印迹印迹鸡的鸡的β肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出免疫学方法免疫学方法 重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为： 小结小结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体细胞转入受体细胞筛筛筛选重组体筛选重组体 熟悉蛋白熟悉蛋白质的分子的分子组成特点；氨基酸的化学成特点；氨基酸的化学结构、分构、分类、三字符号及理化性、三字符号及理化性质；；肽及多及多肽链的两端；谷胱的两端；谷胱甘甘肽。

掌握蛋白掌握蛋白质一至四一至四级结构的概念、要点、主要化学构的概念、要点、主要化学键及模体及模体(motif)、、结构域构域(domain)、分子伴、分子伴侣(chaperon)的概念掌握蛋白掌握蛋白质重要的理化性重要的理化性质熟悉蛋白熟悉蛋白质分离和分离和纯化的方法及其原理化的方法及其原理掌握核酸的分掌握核酸的分类、生物学功能、分子、生物学功能、分子组成、化学成、化学结构构特点掌握核酸一掌握核酸一级结构的概念及构的概念及连接接键掌握掌握DNA的碱基的碱基组成及成及Chargaff规则、、DNA的双螺旋的双螺旋结构要点熟悉熟悉DNA的超螺旋的超螺旋结构、核小体的构、核小体的组成掌握掌握RNA的分的分类、、mRNA的的结构特点、构特点、tRNA一一级结构构及二及二级结构的特点、构的特点、rRNA的功能掌握掌握DNA的的变性、性、DNA的复性及分子的复性及分子杂交掌握掌握酶的概念熟悉熟悉酶的分子的分子组成：全成：全酶的的组成、成、辅酶与与辅基、金属离子基、金属离子的作用、的作用、维生素构成的生素构成的辅酶与与辅基掌握掌握酶活性中心的概念、活性中心的必活性中心的概念、活性中心的必须基基团。

掌握掌握酶促反促反应的特点：高效性、特异性、可的特点：高效性、特异性、可调节性掌握影响掌握影响酶的反的反应动力学因素、米力学因素、米-曼氏方程式、曼氏方程式、Km与与Vm的意的意义、、酶的最适温度、最适的最适温度、最适pH、可逆性抑制作用的概念、、可逆性抑制作用的概念、类型及其特点型及其特点熟悉不可逆性抑制作用的概念、熟悉不可逆性抑制作用的概念、类型及其特点型及其特点掌握掌握酶原及原及酶原激活的概念、原激活的概念、酶共价修共价修饰的概念、同工的概念、同工酶的概念及特点的概念及特点熟悉熟悉酶原激活的机理；原激活的机理；酶的的变构构调节；化学修；化学修饰调节的特的特点；乳酸脱点；乳酸脱氢酶同工同工酶的种的种类、分布、功能及、分布、功能及临床意床意义 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交表达体系的建立：表达体系的建立： 表达载体的构建表达载体的构建 受体细胞的建立受体细胞的建立 表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达 标准：选择标志标准：选择标志 强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足：表达体系的不足：不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA；；不能加工表达的真核蛋白质；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body) ；很难表达大量可溶性蛋白。

很难表达大量可溶性蛋白1. 原核表达体系原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用表达体系最为常用)大鼠胰岛素原大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌的表达和分泌 优点：可表达克隆的优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、经济缺点：操作技术难、费时、经济 转染转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：磷酸钙转染方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染 电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2.2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）表达载体表达载体pFASTBACI 的物理图谱的物理图谱表达载体表达载体YEpI PT的物理图谱的物理图谱第三第三节 重重组DNA技技术与医学与医学的关系非常密切并前景的关系非常密切并前景远大大DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective一、疾病基因的发现与克隆一、疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。

而认识疾病的分子机制 疾病基因发现的两个典型例子疾病基因发现的两个典型例子: 脆性脆性X综合征综合征Kallmann综合征综合征二、生二、生物制药物制药利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为有望成为2121世纪的支柱产业世纪的支柱产业 美国美国Eli Lilly公司于公司于19821982年首先利用重组年首先利用重组DNADNA技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始迄今为止，已有工程药物时代的开始迄今为止，已有5050多多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益估量的社会效益和经济效益 重组重组DNA医药产品医药产品产 品功 能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF, EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素( 1b, 2a,  2b, )抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO, 酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱。