实验四细菌的分离培养及培养性状的观察.docx

实验四细菌的分离培养及培养性状的观察在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一 从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是 指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁 殖而产生的后代分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污 染的众多杂菌中分离出纯的病原菌细菌分离培养应先从被检材 料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养目的要求1. 学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术2. 了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状3. 了解培养性状对细菌鉴别的重要意义4. 掌握钓菌、纯培养及移植技术操作步骤一.需氧性细菌分离培养法1. 平板划线分离法种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种 分离，此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向 连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分 散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的但 划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才 可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20ml培I—养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。

划线分离主要有连续 划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种划线法示意图见 图 4-31）连续划线法图4-1连续划线法图4-2 分区划线法图4-3划线分离 示意图I—以无菌操作用接种环直接取 平板上待分离纯化的菌落将 种点种在平板边缘一处，取出接 种环，烧去多余菌体将接种环 再次通过稍打开皿盖的缝隙伸 入平板，在平板边缘空白处接触一 下使接种环冷却，然后从接种细* 的部位在平板上自左向右轻轻划 线，划线时平板面与接种环面成 30〜40度角，以手腕力量在平板表 面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入 培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积， 注意勿使前后两条线重叠划线完毕，关上皿盖灼烧接种环， 待冷却后放置接种架上培养皿倒置于适宜的恒温箱内培养培 养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面2）分区划线法（四分区划线法）取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似分区划线法划线分离时平板分4个区，故又称四分区划线法其中第4区是 单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大为防止第4区内划 线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行， 这样区与区间线条夹角最好保持120度左右。

先将接种环蘸取少 量菌在平板上1区划3-5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖， 将平板转动60〜70度灼烧接种环，待在平板边缘上冷却后，再 按以上方法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区作第2次平 行划线第2次划线完毕，同时再把平皿转动约60〜70度，同样 依次在3、4区划线划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，倒置于37r恒温箱中培养24h后，在划线区观察单菌落2. 倾注平皿分离法被检材料若含有两种或两种以上细菌时，可借助溶化的琼脂 将细菌稀释，待琼脂冷凝后，分散的细菌就被固定在原地形成菌落. 这样也能达到分得纯种的目的根据材料中存在菌数的多少，倾 注平皿前可将被检材料不稀释或用生理盐水作适当稀释其具体方法如下：EM取三支预先准备的普通琼脂培养基试管，水浴加热融化，冷 至约50T，用火焰灭菌接种环钓取待分离物接种至第一管内，充 分摇匀后，自第一管取一接种环内容物至第二管，以同样方法自 第二管移种至第三管然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后 倒转置于37C温箱内培养24h结果多数细菌在琼脂内生长成* 落，仅少数菌落出现在表面，通常第一个平板内的菌落数较多而密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。

3. 芽胞需氧菌分离培养法如果被检材料中可疑有带芽孢的细菌，可先将被检材料加少 量生理盐水或肉汤，置于80T水浴箱中维持15〜20分钟，或85笆 加热10分钟，再进行培养材料中若有带芽孢的细菌仍可存活而 生长繁殖，不耐热的细菌繁殖体则被杀灭4. 利用化学药品的分离培养法(1) 抑菌作用有些药品对某些细菌有极强的抑制作用，而对 另外一些细菌没有抑制作用，所以可利用这种特性进行细菌的分 离，例如通常在培养基中加入结晶紫或青霉素等化学药品来抑制革兰氏阳性菌的生长，以分离得到革兰氏阴性菌2) 杀菌作用将病料如结核病料用15%硫酸溶液处理，其 他杂菌均被杀死，而结核杆菌因具有抗酸性而存活3) 鉴别作用利用细菌对某种糖的分解能力，通过培养基中 指示剂的变化来鉴别某种细菌例如远藤氏培养基可以用来鉴别大肠杆菌与沙门氏杆菌5. 实验动物分离法CTACTAEM被检病料中疑有某种病原菌存在，可将病料以无菌操作取出， 放入灭菌乳钵或组织匀浆器内，加3〜5倍量无菌生理盐水制成混 悬液，吸取一定量混悬液注射(肌肉、腹腔、皮下或静脉)入易 感实验动物，待实验动物死后，取其脏器，常可分离到纯的病原菌 例如，疑有猪丹毒杆菌存在的病料，可注射于鸽体，鸽死后，再取其脾脏以分离猪丹毒杆菌，可得到纯培养。

6. 琼脂斜面分离法取琼脂斜面3管，用接种环蘸取欲检病料少许（如为脏器， 先将表面烧烙后，用灭菌解剖刀切开，以灭菌接种环由切口插入、 转动、钓取组织），混合于第1管的凝集水中，再作斜面划线；然 后抽出接种环，不经烧灼，继续在第2管、第3管斜面上作同样 划线划毕，置37P温箱中培养经此法分离培养后，第2管的 落较第1管为少，第3管的菌落更少，如此较易得到单个菌落, 达到纯培养之目的7. 琼脂平板涂布分离法被检病料如血液、腹水等，可用灭菌毛细吸管或吸管吸取1〜 2滴置于平板中央，用灭菌的L形玻棒作均匀涂布如估计细 数很多，可直接用火焰灭菌的接种环钓菌，并做分区划线如为 脏器病料，可先作成乳悬液再行涂布；或取其一小块，用镊子夹 住，表面烧烙后，用灭菌刀切开，以其切面直接进行涂布，此法 适用于含菌量较少的病料的分离8. 营养肉汤分离法当组织病料中含病原菌少，或有抗菌药残留时，用上述琼脂斜面或平板分离法可能无菌落长出，这时可以无菌操作剪取一小块病料直接投入肉汤，经37P培养，在肉汤中长出细菌后，再用琼脂斜面或琼脂平板分离二、厌氧性细菌分离培养法细菌接种后，直接放在恒温箱内培养，可以使需氧菌与兼性厌氧菌生长繁殖；但对厌氧菌，则需将培养环-来源网络，仅供个人学习参考境或培养基中的氧气除去，或将氧化型物质还原，降低其氧化还原电势，才能生长繁殖。

在有氧的环境下，培 养基的氧化还原电势较高，不适于厌氧菌的生长为使培养基降低电势，降低培养环境的氧分压是十分必要的 现有的厌氧培养法很多，主要有生物学法、化学法和物理学法，可根据各实验室的具体情况而选用一） 生物学方法培养基中含有植物组织（马铃薯、燕麦、发芽谷物等）或动 物组织（新鲜动物组织小片，或加热的肌肉、心脑等），因组织的 呼吸作用，以及组织中可氧化物质的氧化而消耗氧气（肌肉、脑 磷脂中不饱和脂肪酸的氧化，碎肉培养基的应用），造成厌氧环境， 以利于厌氧性细菌的生长繁殖同时，组织中所含的还原性化合 物（谷胱甘肽）也可使氧化-还原电势下降此外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一环境中，则环境中 的氧被需氧菌消耗，造成厌氧环境，也有利于厌氧菌的生长繁殖1. 动物组织及其他物质加入法在液体培养基内加入肝脏、肾 脏等动物脏器，因其中的半胱氨酸的一 SH基极不稳定，为强还原 剂，所以可利用此培养基进行厌氧培养，在培养之前将肝片肉汤加热，以驱出空气，冷却，然后接种培养2. 共栖培养法将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一个平皿内， 利用需氧菌的生长繁殖将氧气消耗后，造成厌氧环境利于厌氧 生长其具体方法是将培养皿的一半接种消耗氧气能力极强的需 氧菌如灵杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌等。

另一半接种厌氧菌，接 种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37T恒温箱中培养2〜3d，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长二） 化学方法利用还原能力强的化学物质，将环境或培养基内的氧气消耗， -来源网络，仅供个人学习参考或还原氧化型物质，降低氧化-还原电势1. 焦性没食子酸法焦性没食子酸在碱性溶液内能大量地吸收 氧而造成厌氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖通常100cm3空间 用焦性没食子酸1g及10%氢氧化钠或氢氧化钾10m1具体方法 有下列几种：(1) 平板培养法将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板，取一 小团直径约2cm的脱脂棉，置于平皿盖的内面中央，其上滴加 0.5ml10%氢氧化钠溶液；在靠近脱脂棉的一侧放置0.5g焦性没 食子酸，暂勿使两者接触立即将已接种的平板覆盖于平皿盖上， 迅速用融化的石蜡密封平皿四周封毕，轻轻摇动平皿，使被氢 氧化钠溶液浸湿的脱脂棉与焦性没食子酸接触，然后置37P恒温 箱中培养24〜48h后，取出观察2)Buchner氏试管法(图 图4-4Buchner氏厌氧培养法图4-4)取一大试管，在管底放焦 4-5瑞氏厌氧培养法 性没食子酸0.5g及玻璃珠数个或放一螺旋状铅丝。

将已接种 的培养管放入大试管中，迅速 加入2 %NaOH溶液0.5ml，立即 将试管口用橡皮塞塞紧，必要时周围用石蜡密封37P培养24〜 48h后观察EM 妃(3) 瑞氏厌氧培养法(图4-5)将已接种细菌的培养管的脱 脂棉棉塞在火焰中灼烧灭菌后，塞入管中离培养基1〜1.5cm处，置适量焦性没食子酸于其上，加入10%NaOH溶液2ml,迅速用橡皮塞将管口塞紧，以胶泥或石蜡严密封闭置温箱中培养4） 史氏厌氧培养法用图4-6所示的厌氧培养皿，在皿底一 边置焦性没食子酸，另一边置NaOH溶液，将已接种的平皿翻盖于 皿上，并将接合处用胶泥或石蜡密封，然后摇动底部，使氢氧化钠与焦性没食子酸混合，置温箱中培养5） 平皿厌氧培养法置一片中有小圆孔的金属板于两平皿之 间，上面的平皿接种细菌，下面的平皿盛焦性没食子酸及氢氧化钠溶液，用胶泥封闭后置温箱中培养（图4-7）（6） 玻罐或干燥器法置适量焦性没食子酸于一干燥器或玻罐 图4-6史氏厌氧培养法图4-7平的隔板下面，将培养皿或试管皿厌氧培养法 置于隔板上，并在玻罐内置美兰指示剂一管，从罐侧加入氢 氧化钠溶液于罐底，将焦性没 食子酸用纸或纱布包好，用线 系住，暂勿与氢氧化钠接触，等一切准备好后，将线放下，使焦 性没食子酸落入氢氧化钠溶液中，立即将盖盖好，密封，置温箱 中培养。

2. 李伏夫氏法此法是利用连二亚硫酸钠 （Sodiumhyerosulphite）和碳酸钠以吸收空气中的氧气,释放二 氧化碳造成厌氧环境其反应式如下：Na SO +Na CO +O —Na SO +Na SO +CO2 2 4 2 3 2 2 4 2 3 2=5 =2取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠 正放于罐内(如是液体培养基，则直立于罐内)，最上端保留可容 纳1〜2个平皿的空间(视玻罐的体积而定)，按玻罐的体积每 1000cm3空间用连二亚硫酸钠及碳酸钠各30g，在纸上混匀后，盛 于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免 罐内水分过多若用无盖玻罐，可将平皿重叠正放在浅底容器上, 以无盖玻罐置于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭，如图4-8所示3. 硫乙醇酸钠法硫乙醇酸钠是一种还原剂，加入培养基中， 能除去其中的氧或还原氧化型物质，促使厌氧菌生长其它可用 的还原剂包括葡萄糖、维生素C及半胱氨酸等1) 液体培养基法将细菌接入含0.1%的硫乙醇酸钠液体培养 基中，并加入美兰溶液作为氧化还原的指示剂，37T培养24〜48h后观察，在无氧条件下，美兰被。