无菌检查法药品无菌检查规程.docx

一、 目 的：阐述无菌检查规程二、 适用范围：适用于无菌检查规程三、 责任者：品控部四、 正 文：1概述无菌检查是检查药品、敷料、缝合线、无菌器具及适用于中国兽药典要求无菌检查的其 它品种是否染有活菌的一种方法无菌检查的操作环境和全部过程应严格遵守无菌操作该检查法根据供试品有无抑菌作用而采用薄膜过滤法或直接接种法两种方式2仪器、设备和用具无菌室分无菌操作室和缓冲间在缓冲间应有洗手盆、毛巾、无菌衣裤放置架及挂钩、 拖鞋等无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，局部洁净度100级或放置同等 级别的超净工作台，室内温控（25±2）°C及除湿装置缓冲间及操作室内均设置能达到空气 消毒的紫外灯和照明灯，操作室或工作台应保持正压2.1.1无菌室应每周和每次操作前用％新洁尔灭或2%甲酚液或其他适宜消毒液擦拭操 作台及可能污染的死角，开动无菌空气过滤器及紫外灯杀菌半小时在每次操作完毕，同样 上述消毒溶液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌半小时2.1.2无菌室的无菌程度检查无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查 空气中菌落数；取直径约90mm双碟，在接种室内点燃乙醇灯，在乙醇灯旁，以无菌操作， 将双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml，制成平板，在30〜35C培养48小时，取出 检查，100级清洁度要求：3个平板上生长的菌落数平均不得超过1个。

无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到100级（一般用尘 埃粒子计数仪）检测尘埃粒径＜5um的粒数不得超过个/升；空气流量应控制在〜S；细菌菌 落数平均V1个，可根据无菌状况必要时置换过滤器恒温培养箱及可调20〜25C的生化培养箱离心机、显微镜、蒸汽灭菌器、标准PH比色器%酚磺酞指示液和溴钾酚蓝指示液）、 恒温烤箱玻璃器皿 试管、量筒、三角瓶、移液管、刻度吸管（1、5、10ml）、注射器（2、5、10ml）、双碟等，用玻璃洗涤剂或清洁液浸泡，水洗3次使用过后如与细菌接触，应先灭 菌倒出内容物后再清洗，晾干凡无菌操作过程中所用的器皿，都应用牛皮纸包扎严密，121°C 灭菌30分钟，或置于耐热容器中盖妥160C干热灭菌2小时2.5.1移液管、刻度吸管在管口上端内，松松地塞少许棉花，然后放于吸管筒内或牛 皮纸袋内，盖严，灭菌备用2.5.2试管、离心管、三角瓶等在管（瓶）口塞上海棉胶专用塞或纱布棉塞，塞子应塞 进管口内2/3之处，用牛皮纸将管口（包括塞子）包扎严，灭菌备用2.5.3将注射器、针头（9号、11号、12号）配对，检查针头是否畅通后，将注射芯、 管和针头分别放在双层纱布（或布）内，包扎严密，置带盖容器（瓷盘或铝制饭盒）内，盖严， 用牛皮纸包扎后，灭菌备用。

无菌衣、裤、帽、口罩等洗净晾干，配套，用牛皮纸包严，灭菌备用或用一次性的无 菌物品代替长柄取样匙，放于长的玻璃筒内（或不锈钢长筒内），盖严，干热灭菌备用微孔滤膜直径50mm、孔径》m购得一批滤膜，需进行孔径大小的测试，一般有三种 方法，选其中一种方法即可气泡法先将滤膜浸入水中，使完全湿润，然后用镊子夹住一片滤膜放于气泡点测定装 置或滤膜孔径测定仪上，膜上放一块与滤膜大小相同的尼龙筛网，再加上多孔板，将螺旋固 定圈旋紧，在多孔板上加3〜5mm深的水（注意排除气泡）关闭放气阀，启动空压机或氮气瓶 阀，使压力缓缓上升，注意观察水面上产生第一个气泡时，记录压力表的压力，气泡点压力 不应小于cm2水流量法 将滤膜装于除菌滤器上，开动真空泵，压力在700mmHg（93kPa）下，抽滤已滤 清的水约500ml，计算出每1min的滤速1995年版中国兽药药典对滤膜的滤速明确规定， 而USP（XXIII）规定在700mmHg（93kPa）压力下，滤膜直径47mm；流速55〜75ml/min细菌过滤法 常用的细菌为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens CMCC（B）41002），将该 菌的新鲜营养琼脂斜面培养物，接种于营养肉汤培养基中，30〜35C培养18〜20小时，用 无菌%氯化钠溶液稀释至10-3 （约相当于7X105CFU/ml），取此菌液1ml加至50ml无菌%氯化 钠溶液中，按薄膜过滤法过滤，取该滤液5ml接种于营养肉汤培养基40ml中，30〜35C培 养24小时，应无菌生长。

不符合规定的滤膜不得使用除菌滤器 目前有多种滤器；如STV2型无菌检查薄膜器及封闭式滤器的准备分述如下：2.9.1 STV2型无菌检查薄膜滤器是由除菌过滤器和底座排液架两部分组成新购置的 滤器，需用毛刷将该滤器的各部件用水刷净，除去垢物，用水冲洗4〜5次，蒸馏水冲洗1 次玻璃筒放于玻璃洗涤液或清洁液中过滤，再用水、蒸馏水洗净、晾干除菌过滤器的装配在滤器的漏斗部上面置1个橡胶圈，圈上加多孔垫板，在垫板上垫 一个四氯乙烯薄膜垫圈，放上乙浸湿的微孔滤膜1片，在其上垫一个四氯乙烯薄膜圈及橡胶 圈，安装玻璃筒，套上金属固定架，拧上底部螺母，漏斗底部套上橡皮塞将已装配妥的滤器放于带盖的瓷盒（或饭盒）中，盖严，外用牛皮纸包扎灭菌备用底座排液架的排液管口接一耐压橡胶管，将管口用纱布，牛皮纸包扎灭菌备用该架经 灭菌后放于无菌室内可反复使用2.9.2 封闭式滤器一般由电脑集菌仪和一次性使用集菌培养器组成前者放于无菌 操作区台面上手术镊、手术剪洗净、擦干用双层纱布将1把剪和1个镊间隔包扎在一起抽滤瓶一般为1000〜2000ml,用水及蒸馏水洗净，晾干瓶口用已配有两个玻璃管（一 个通至瓶底，一个短些）的橡皮塞盖紧，短的玻璃管上套一个短耐压橡胶管。

抽气口用耐压 橡胶管与空气过滤玻璃器（内充填以棉花）相连，空气过滤玻璃器的另一管口用纱布、牛皮 纸包扎严紧，抽气瓶的全部装置用牛皮纸包扎，灭菌备用用具的灭菌 将包扎妥的用具（除另有规定外）在（121土）C蒸气灭菌30分钟，物 品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却，使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，易致染菌应 置恒温培养箱中烘干适于高温灭菌的器皿也可采用160C干热灭菌2小时3试液75%乙醇溶液配制酒精棉球用碘酊溶液配制碘酒棉球用无菌%氯化钠溶液，分装于试管、三角瓶或玻璃瓶中，瓶口用棉塞、橡胶塞或海绵胶 专用塞塞紧并用牛皮纸包扎，灭菌备用也可用氯化钠注射液新洁尔灭（1： 1000）溶液3〜5%甲酚磺溶液或其他适宜消毒溶液酚磺酞指示液〜系列比色液管溴甲酚蓝指示液〜系列比色液管2mol/L盐酸溶液2mol/L氢氧化钠溶液无菌的青霉素酶溶液4培养基一般采用商品脱水培养基，临用时按照使用说明书进行配制，需注意培养基的PH值 应符合规定，否则必须校正后，灭菌使用新鲜配制的培养基，应按中国兽药典规定的处方，对培养基的原材料要进行挑选，化 学药品均需用CP试剂规格4.2.1除葡萄糖和指示液外，将处方中各成分加水后置有石棉网的电炉或适宜的加热 设备中，使微温溶解。

用2mol/L氢氧化钠溶液调节PH，使其比规定的PH值略高〜，煮沸， 用棉(纸)浆减压抽滤或以脱脂棉，滤纸等滤材过滤，使培养基澄清4.2.2加入葡萄糖和指示液，摇匀，补足水量，调节PH值(比规定的PH值略高〜，使 灭菌后为土，分装，装量不宜超过容器的2/3，以免灭菌时溢出培养基灵敏度检查新购的脱水培养基或采用不同品牌原材料的配制的新鲜培养基，其质量均应符合灵敏度 检查要求4.3.1 菌种(1)腾黄微球菌[Micrococcus luteus CMCC(B)28001](2) 生抱梭菌[Clos tridium sporogenes CMCC(B)64941](3) 白色念珠菌[Candida albicans CMCC(F)98001]4.3.2操作4.3.2.1需气菌、压气菌培养基用腾黄微球菌和生抱梭菌两种菌检查取藤黄微球菌的营养琼脂斜面新鲜培养物，加无菌%氯化钠溶液3ml，制成均匀的菌悬液， 再以无菌%氯化钠溶液稀释至与细菌浊度标准管相同的浓度，然后作10倍系列稀释，制成1ml 中含10〜100个菌(CFU)并计数取生抱梭菌的需气菌、厌气菌培养基的新鲜培养物，用灭菌毛细管将其吸至灭菌离心管 内，离心，弃去上清液，取沉淀菌体用无菌%氯化钠溶液制成均匀菌悬液，吸取上述菌悬液， 用无菌%氯化钠溶液稀释，照上述方法制成1ml中含10〜100个菌并计数。

4.3.2.2真菌培养基用白色念珠菌检查取白色念珠菌的真菌琼脂斜面新鲜培养物，加无菌%氯化钠溶液3 ml，制成均匀的菌悬 液，照藤黄微球菌项下方法稀释制成1ml中含10〜100个菌并计数4.3.2.3取藤黄微球菌的营养肉汤，生抱梭菌的需气菌厌气菌培养基的新鲜培养物， 白色念珠菌的真菌培养基的新鲜培养物各1ml，用无菌%氯化钠溶液作10倍系列稀释，制成 1ml中含10〜100个菌并计数4.3.2.4将藤黄微球菌的上述之一的稀释液各1ml,分别接种至每管装量为9ml的需气 菌、厌气菌培养基3管，生抱梭菌的上述之一的稀释液各1ml,分别接种至每管装量为12ml 的需气菌、厌气菌培养基3管，以未接种的培养基作对照，按规定的温度培养5天，并逐日 记录结果4.3.3结果判断以每株菌接种后的培养基不得少于2管呈现生长，即该培养基的灵敏 度检查符合要求配制的培养基应保存在凉暗处，一般不得超过2周，临用前细菌和真菌培养基分别经 30〜35°C和20〜25°C培养不少于48小时和72小时，证明无菌生长后方可使用需气菌、厌气菌培养基的指示剂氧化层不得超过培养基深度的 1/5,否则经水溶煮 沸10分钟，但只限加热一次。

无菌试验培养时间结束时，指示剂氧化层应不超过培养基深 度的1/25对照用菌液的制备试验用菌种、菌种的复苏、转种与保存等均应按照“抗生素微生物检定法”标准操作 规程项下操作金黄色葡萄球菌菌液用接种环取金黄色葡萄球菌［Staphylococcus auteus CMCC (B) 26003］的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，接种至需气菌、厌气菌培养基内，在30〜35C培养 16〜18小时，用无菌%氯化钠溶液稀释制成每1ml中含1〜100个菌生抱梭菌菌液用接种环取生抱梭菌［Clostridium sporogones CMCC(B)64941］的需气 菌、厌气菌培养基新鲜培养物少许，接种至相同的培养基内，在30〜35°C培养18〜24小时， 用无菌%氯化钠溶液稀释制成每1ml中含1〜100个菌白色念珠菌菌液用接种环取白色念珠菌［Candida albicans CMCC(F)98001］的真菌琼 脂培养基斜面培养物少许，接种至真菌培养基内，在20〜25°C培养24小时，用无菌%氯化钠 溶液稀释制成每1ml中含1〜100个菌上述制备的菌液，一般当日使用6抑细菌和抑真菌试验取每管装量为9ml的需气菌、厌气菌培养基4管及真菌培养基2管，分别接种金黄色葡 萄球菌、生抱梭菌、白色念珠菌10〜100个菌各两管，其中1管加供试品规定量，按规定的 温度培养3〜5日，如培养基各管24小时内微生物生长良好，则供试品无抑菌作用。

如加供 试品的培养基管与未加供试品的培养基管对照比较，微生物生长微弱、缓慢或不生长，均判 断为供试品有抑菌作用该供试品需用稀释法或中和法、薄膜过滤法处理，消除供试品的抑 菌性后，方可接种至培养基7 检查法 采用直接接种法和薄膜过滤法前者适用于非抗菌作用的供试品；后者适 用于有抗菌作用的或大容量的供试品供试品检验量和培养基用量照中国兽药典2005年版无菌检查法项下表1、或表2、表 3规定，备妥除供试品外，培养基在移入缓冲间前应先编号，并廉新洁尔灭或酒精棉擦拭 瓶（管）外壁，然后连。