国标-》以穿膜肽为载体的分子治疗及分子影像研究进展.doc

同时，发挥多层CT的强项，高清晰地显示示踪剂浓聚部位的精细结构特征和周围解剖关系 PET／CT利用同机的多层CT功能，有助于观察病变细节和小病灶，克服部分容积效应伪像， 便于临床医生的理解与应用这种融合影像，放大了各自的技术潜力，提高病变的检测能力 和准确性，减少检查和分析所需时间，提高治疗的科学性、安全性和有效性，产生了1+1> 2的效果所以有人说：PET／CT是“连接影像医生和临床医生的桥梁”相信核医学将以此 为契机，扩大与超声、放射、放疗、MRI等技术的互相借鉴、互相渗透，更好服务于国人健 康事、I匕以穿膜肽为载体的分子治疗及分子影像研究进展郭佑民刘敏西安交通大学医学院第二附属医院影像中心(710004) 随着对生 命现象及疾病本质的深入研究，人类已经认识到绝大多数疾病只有在分子水平诊断治疗，才能达到真正意义上的“治愈”，但是其中面f临的一个主要问题是许多有“诱人的 前景”的生物活性大分子由于细胞膜天然屏蔽的限制作用无法进入细胞内发挥它们作用，此 外像DNA等大分子通过胞吞作用进入细胞u1，在内涵体内运输，最终在溶酶体内被溶酶体酶 降解目前使用的显微注射法或电穿孔法这样的方法用于传递无生物膜穿透性的分子，在本 质上是有细胞创伤性的，可能损伤甚至破坏细胞膜心’31而非侵袭性的方法包括使用对pH敏感 的脂质体H’，则要求低酸环境下在内涵体的膜失去稳定性从而释放内嵌的药物进入胞质，对 于人体生理环境中药物作用的研究具有一定局限性。

传递这些分子的最新方法是把它们结合细胞膜穿透肽上，携带分子传递到细胞内本文 就以穿膜肽为载体的分子治疗和分子影像研究进展作一综述，以提高对穿膜肽在分子水平成 像及治疗价值的深入认识 一、胞穿膜肽发展史 细胞穿膜肽(cell—penetrating peptides CPPs)又称蛋白转导域(protein translocation domain PTD)，是一大类由10～30个氨基酸组成的短肽1988年，Green和 Frankel两个独立课题组等嫡’6 1同时报道了人的免疫缺陷病毒(HIV)中有一种转录调节蛋白TAT，它能进人细胞核激活HIV一1的启动子从而促进HIV的扩增最初研究人员的焦点集中 在TAT对HIV的启动作用，但是随后的研究发现TAT蛋白本身具有一种极其特殊的生物学 活性：它可以直接穿过细胞膜、细胞核膜并锚着于特异的基因调控区内之后的大量研究又 发现了来源、氨基酸组成、转运速度各不相同但都具穿膜转运功能的短肽，学者 Eiriksdottir¨根据这些短肽的特点，来源将其分为蛋白衍生肽(protein derived CPPs)、 模型肽(model peptides)以及设计肽(designed cpps)三大类，尽管穿膜肽氨基酸组成、 结构各不相同，转导机制还不是非常清楚，但是多年研究哺。

2副已经证实：①cPPs均具有净正电 荷性；‘②穿膜转运效率高(R9>穿膜素>Tat)其介导的转导过程不依赖于受体和转运蛋白，也 不需要能量，转运不受温度影响，在4℃下仍然可以进行转导和穿膜；③可以导入近乎所有的细胞，包括破骨细胞、外周血单核细胞及原代细胞等常规方法难以转染的细胞，甚至还可以穿过血脑屏障心扣劓1；④不但可以单独跨膜进入细胞，而且可以携带多种活性物质进人细胞； ⑤可以通过固相合成或原核表达制备，方法成熟简便正是由于穿膜肽具备了以上的优势，自 穿膜肽发现以来人们利用穿膜肽技术已将蛋白质、抗体、核酸、显像剂、脂质体等多类物质 导入细胞一叫制，为疾病研究、诊断及治疗提供了新的手段目前利用基因重组技术制备穿膜 肽HIV—Tat和其他蛋白质的重组蛋白用于疾病治疗也是我国研究的热点比玑29棚’3扣矧，并以取 得了可喜的成果二、穿膜肽的应用大量研究表明穿膜肽具有强大的运载潜能，不仅可以携带多肽、GFP、RNA酶、半乳糖苷 酶等蛋白质，而且可以携带DNA、反义核酸、荧光素、有机分子、脂质体及铁颗粒等无机物 运载能力可以达到120 kD(如半乳糖苷酶)、40 nm(如铁颗粒)，没有明显的证据表明运载 极限‘叫训。

1．转运蛋白：穿膜肽可以结合多种蛋白将其带人靶细胞体外研究显示TAT肽削可以携 带B一半乳糖苷酶，辣根过氧化物酶，RNA酶A，和假单胞菌外毒素A(PE)的Ⅲ区，进入不 同类型的细胞体内研究TAT—p一半乳糖苷酶可以传递到不同的组织内，在心、肝、脾内活性高，在肺和骨骼肌内低到中等程度，在脑和肾中很少或没有腹腔内注射融合到TAT一116一kD 8一半乳糖苷酶后这种有生物活性的融合蛋白分布老鼠全身各组织，包括脑的广泛分布汹1外源性蛋白不能迸人细胞，并且发生MHC I类免疫反应因此很难设计一种以蛋白为基 础的疫苗因为它可以诱导I类限制性的细胞毒T淋巴细胞的反应，但是在把抗原蛋白结合到 TAT后，如TAT一卵清蛋白结合物，形成的结合物能被抗原提呈细胞提呈处理，并启动抗原特异性的CTLS细胞的免疫应答将靶细胞有效的杀死¨饥研究表明通过使用TAT融合蛋白可以 显著地提高细胞内的蛋白转导¨㈣引TAT融合蛋白全长范围从15到115 kDa，可以在多种类 型的细胞内转导如外周血淋巴细胞，，所有的血淋巴细胞，骨髓干细胞，破骨细胞，骨肉瘤细 胞，纤维肉瘤细胞，神经胶质瘤，肝细胞癌，肾癌，角质化细胞等。

在体内一些用于转导的 融合蛋白有TAT—p27Kipl，TATCdk2dom-neg，TAT—HSV—TK，TAT—pRB等穿膜肽介导的蛋白转导亦可在胰岛细胞移植的领域，这个领域本身由于在分离过程中会 触发胰岛细胞程序性死亡而受到限制，TAT PTD区与抗凋亡蛋白Bcl—X(L)和PEA一15的融合 可以有效地在体外转导胰岛，并阻止胰岛细胞的凋亡及不影响胰岛分泌胰岛素的能力因此 这种体系可能会提高胰岛的移植存活率№引TAT PTD区与红细胞凝集素或神经钙蛋白仪形成 的融合蛋白能刺激成骨细胞的分化和抑制破骨性吸收，这为使用有关骨细胞分化和功能的分 子形成融合蛋白提供了一个发展基础拍训 穿膜肽融合蛋白可以处理氧化应激紊乱TAT与人类CU，Zn一超氧化物歧化酶(cu，Zn—SOD) 的基因融合TAT—SOD的融合蛋白，以依赖时间和浓度的方式穿入细胞，比天然蛋白更有效， 以 补充更多的cu，Zn—SOD来处理与这种过氧化物酶有关的紊乱№“同样地，人类肝过氧化 氢 酶(CAT)基因与9精氨酸的模肽融合产生Ar99一CAT为框架的融合蛋白，以时间和浓度依 赖 的方式穿透到哺乳动物的细胞内当受到氧化应激的作用时，这些转导细胞的存活力显著 增 加。

此外其他异源性基因如HSV—TK，B1一rambo，Smac／DIABLO、GFP等均可以融合蛋白的形 式 被TAT PTD(47—57)转入细胞应激原，补充谷氨酸脱氢酶以防其缺乏引起的紊乱嘲1 穿膜肽介导的可应用于通过使用以树突状细胞(Dc)为基础的免疫治疗消灭肿瘤TAT 携带重组肿瘤相关抗原(卵清蛋白)穿人树突状细胞表达这些蛋白的表位，激活细胞毒性淋 巴细胞消灭肿瘤¨州免疫接种装载有TAT PTD—TRP2的Dc细胞，可以发挥完全的保护性免疫 作用，并能显著的抑制肿瘤的肺转移单纯疱疹病毒VP22蛋白用于传递E2蛋白到靶细胞 E2蛋白在宫颈癌细胞内过度的表达可以诱导细胞的生长停滞和凋亡因此E2蛋白可能对宫颈 癌的治疗有用VP22一E2融合蛋白诱导在短暂的转染的由人类乳头瘤病毒(HPV)转化的宫颈 癌细胞系凋亡当把能产生VP22一E2的COS一7细胞种植到HPV一变异细胞的培养基中，VP22一E2 进入到不产生这种蛋白的其他细胞内诱导凋亡，这表明VP22一E2融合蛋白的局部的传递，可 以用于治疗宫颈癌和HPV相关的疾病VP22提高细胞内胸苷激酶(TK)的传输，并放大了 TK／甲基鸟嘌呤(GCV)细胞的杀伤作用，尤其是在GCV浓度低下，这提供了提高自杀基因治疗肿瘤的功效一种新的途径““。

穿膜肽介导的蛋白转导可以用于缓解炎症转录因子NF—K B是炎症介质而致炎细胞因子如TNF一仅和IL一1 B通过激活NF—KB调解他们的活性，因此降低NF—KB活性的方法会对慢性 炎性有帮助非磷酸化、非降解的超抑制物IKB仪(srIKB 0【)突变体能强烈的抑制NF—KB14的活性TAT PTD与突变体的融合，能被细胞快速高效的摄取，以浓度依赖的方式抑制TNF— a 和IL一1 B诱导的NF—KB的活性和NF—K B介导的转录这种方式提供了一个调解炎症的 新方法¨2|穿膜肽介导的蛋白转导另一个可能的应用心脏或脑组织的缺血保护，使用遗传性的 TAT—ARC框架(带有半胱天冬酶补充区的抑制细胞凋亡的物质)或者是TAT一8一gal融合蛋白 在细胞培养液或是成年老鼠心脏的Langendorff灌流系统TAT—ARC可以保护H9C2细胞防止被过氧化氢杀死TAT—ARC和TAT—B—gal能容易的转导到隔离的灌注的心脏在全心缺血和再灌注之前给药，TAT—ARC显示出保护心脏的作用n引在脑缺血时，TAT PTD可传递有生物 活性的神经蛋白Bcl—xLTAT PTD和Bcl—xL融合蛋白(称作PTD—HA—Bcl—xL)可以在培养液中高效得转导蛋白，同样可以携带蛋白透过血脑屏障。

当注入腹膜内时，融合蛋白在1～2 h 内转导入脑细胞并以浓度依赖的方式能降低局部脑缺血90分钟后的脑梗死即使是脑缺血 (达到45min)以后给药，融合蛋白依然有效此外，它在缺血的神经细胞内能降低由缺 血诱导的半胱天冬酶一3的活性同样的，TAT PTD与由Bcl—xL的定向诱变获得的人工合 成的细胞保护性蛋白FNK融合TAT PTD—FNK融合蛋白防止培养的神经细胞神经兴奋性中毒 和程序性死亡当对沙鼠静脉给药时，它可以降低缺血造成的海马的CAI神经细胞的损害2．传递抗体：某些抗体需要传递到细胞内来发挥他们的杀癌效应m但是免疫球蛋白本 身不能穿过细胞膜目前使用不同的方法来传递抗体到细胞内如电穿孔法、显微注射法但由 于这些方法能导致细胞膜的破坏和降低细胞的存活率而受到明显的限制皑一因此CPPs被考 虑用于抗体的胞内传导TAT蛋白37—62序列区的肽类似物当与不能被细胞摄取的抗肿瘤抗 体Fab片断结合，提高在试管内细胞表面的滞留和达到这些片断被全部摄取的水平嘲1TAT (37—72)用于在细胞内中和破伤风毒素(TET)o因为TET在神经细胞内降解速度非常地慢， 需要抗TET的抗体来中和破伤风毒素。

用常规的方法电穿孔法传递抗体，不能在临床上使用 而硫醚和二硫化物与抗破伤风片断F(ab)2和TATp(37—72)的结合物能被细胞摄取，二硫 化物的结合物也是一种在细胞内中和破伤风毒素的物质u制传递抗体的另一种新方法是使用 TAT融合蛋白从遗传上设计的融合蛋白有两个功能区组成：TAT PTD区和葡萄球菌蛋白A (SpA)的B区，这区域可以连接IgG的Fc片断TAT—SpA融合蛋白当结合到IgG上表现出 以时间和浓度依赖的抗体的胞内传导u011 3．脂质体的传递：一个具有挑战性的工作是如何使用PTDS胞内传递药物载体如微粒，脂 质体和纳米微粒等u川已知平均40 nm大小的纳米微粒通过TATp能有效地传递到淋巴细胞 内已报道通过多重TATp分子黏附到脂质体表面(TATp一脂质体)，200 nm的脂质体可以被 传递到各式各样的细胞内[118,119]TATp一脂质体在1 h内穿入细胞，在细胞质内仍保持完整 随着时间延长它们缓慢的迁移到核周区并最终在那裂解TATp一脂质体包含一段很小数量的阳离子性脂质，与DNA形成以非共价键紧密结合的复合物这种TATp一脂质体一DNA复合物能在 活体内外在正常细胞和肿瘤细胞内传染，其细胞毒性比通常使用的以阳离子性脂质为基础的 基因传递系统要低。