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广东工业大学 硕士学位论文 荧光光谱法用于天然产物的鉴别和定量分析 姓名：曹佳佳 申请学位级别：硕士 专业：应用化学 指导教师：陈小康 20100401 摘要 摘要 荧光光谱法是一种灵敏、快速和简便有效的对物质进行定性和定量分析的方 法在对物质定性分析方面，三维荧光光谱应用较多，主要是通过直观比较光谱 图的某些参数来对物质进行分类鉴别，带有人为性和不确定性在定量分析方面， 荧光光谱法适用于分子中具有大的共轭7 c 键结构或刚性平面结构的物质，具有一 定的局限性 本研究利用图像信息统计法提取了三维荧光等高线特征谱，该特征谱能较全 面地反映物质的三维荧光光谱特征，并具有特征性和可计算性，解决了模式识别 中特征参数提取的问题，基于特征谱，实现了对不同种天然产物分类鉴别的目的 本研究还尝试用荧光光谱法对六种灵芝( 紫芝、黑芝、赤芝、松杉灵芝、泰山灵 芝、龙芝) 的多糖含量进行了测定主要内容包括： 1 、基于等高线特征谱提取的原理，利用V i s u a lB a s i c 6 ．0 设计了三维荧光等 高线识别软件该软件能够进行等高线图谱浏览，可以提取等高线特征谱并进行 等高线特征谱比对，还可以进行平均波长、相关系数、欧式距离等的计算，以及 对不同样本进行平面距离聚类分析、相关系数平面聚类分析等。

2 、提取了不同种饮料的三维荧光等高线特征谱并对其规律进行研究对橙 汁、绿茶、凉茶三类3 3 个饮料样本进行了三维荧光光谱的测定，并提取了每个 样本的特征谱，比较了同种饮料样本的特征谱的变化规律以及不同种饮料的特征 谱之间的差异基于特征谱，计算了各个样本与参考点样本之间的平均相关系数 尺，得到平均相关系数直方图，R 0 ．6 6 为橙汁饮料，0 ．4 2 0 ．9 0 0 0 的为 花生油，介于0 ．7 0 0 0 到0 ．9 0 0 0 之间的为调和油，相关系数月小于0 ．1 0 0 0 甚至为 负值的为芝麻油以‰、如、R 为基，建立三维立体图，对样本进行三维聚类 分析，结果见图5 —3 第五章三维聚类分析法在食用油分类鉴别中的应用 图5 - 3d E m ．如．R 关系三维图 F i g ．5 —33 一Dm a po fd E m —d E x —R 2 图5 ．3 为食用油样本的三维聚类图，图中，“·”为花生油，“木，’为调和油， “0 ”为芝麻油，各类样本聚集在一定的空间内，很明显该图对三类食用油样本 有很好的聚类作用‰．如一尺三维图将欧式距离和相关系数两种判别参数融为一 体，这种方法与单纯的平面距离聚类或平面相关系数聚类相比，更能够全面、直 观地显示样本点的分布规律。

所以，三维聚类分析法能很好地实现对不同种样本 的分类鉴别 5 ．3 本章小结 首先测定了3 类2 9 个食用油样本的荧光光谱，并提取了等高线特征谱，利 用模式识别方法，得到了样本的欧氏距离‰、如及相关系数R ，以‰、如、 尺为基，建立了三维聚类分析方法，根据样本点在三维空间的分布，很好地实现 了对不同类食用油分类鉴别的目的这种方法较相关系数聚类法和平面距离聚类 法更直观、更全面 4 5 广东工业大学硕士学位论文 第六章荧光光谱法用于不同种灵芝中 多糖含量的测定 灵芝属于担子菌亚门，多孔菌属，灵芝科，是一类大型真菌，是祖国中医药 宝库中的珍品，素有”仙草”之誉灵芝始载于《神农本草经》，被认为能“益心气”、 “安精魂”、“补肝益气”、“坚筋骨“ ，列为上品【6 3 】灵芝中含有三萜类、多糖类、 核苷类、生物碱类、呋哺衍生物类、多种酶类、氨基酸多肽类、甾醇类、多种微 量元素及有机锗、脂肪酸、烟酸等十几类近千种化合物( 复合物) 具有生理活 性的成分主要有三萜类、多糖类、核苷酸类、氨基酸、微量元素及有机锗、生物 碱类其中，多糖类化合物一度被认为是灵芝中的主要功效成分，并证明其对心 血管疾病、气喘、过敏、神经衰弱、胃热等有显著效果，同时还具有降血 压、降血脂、解血瘀、改善血液循环、皮肤美容等作用。

从2 0 世纪7 0 年代 开始，多糖一直就是科学家们研究灵芝功效的主要对象，现在也有许多厂商喜欢 以多糖体的含量多少作为产品的主力诉求灵芝的种类较多，早在明朝医师李时 珍的《本草纲目》中就详细记载了六种：紫芝、黑芝、赤芝、白芝、青芝( 又名 龙芝) 、黄芝不同种灵芝所含的多糖也有所不同，究竟哪种灵芝中多糖含量较 多，这是许多厂商及有多糖需求的人们迫切想知道的 目前，灵芝中多糖含量的测定方法较单一，报道的较多的是紫外分光光度法， 该法主要是利用多糖与一些试剂呈颜色反应，测定其吸收度和含量成线性关系的 原理进行，依显色剂的不同又可分为苯酚．硫酸法【6 4 击7 1 、蒽醌．硫酸法【6 8 捌】等虽 然显色剂不同，但所用仪器均为紫外分光光度计，存在一定的局限性 本研究首次用荧光光谱法，测定了六种灵芝中的多糖含量，并与《中华人民 共和国药典( 2 0 0 5 年版) 》中灵芝多糖的测定方法进行了比较，结果证明这种方 法操作简便，快速，灵敏度高和重复性好，可用于灵芝及其它相关产品中多糖含 量的测定 第六章荧光光谱法用于不同种灵芝中多糖含量的测定 6 ．1 实验原理 图6 - 1 不同产物的荧光光谱图 a ．苯酚+ 浓硫酸；b ．葡萄糖+ 浓硫酸+ 苯酚 F i g ．6 - 1F l u o r e s c e n c es p e c t r u mo fd i f f e r e n tp r o d u c t s a ．p h e n o l & c o n c e n t r a t e ds u l f u r i ca c i d ；b ．g l u c o s e & c o n c e n t r a t e ds u l f u d ca c i d & p h e n o l 荧光通常发生于具有刚性结构和平面结构n 电子共轭体系的分子中，随着 n 电子共轭度和分子平面度的增大，荧光强度随着增大，光谱相应红移，芳烃苯 环数目的增加，其荧光光谱的形状和强度也相应发生变化，因此荧光光谱是提供 芳烃类组分分布与浓度大小的一种特效测试手段之一【7 1 1 。

多糖本身并不是荧光物 质，用荧光光谱仪无法测定，但是，可以利用其它试剂与多糖反应后生成荧光物 质，根据产物的荧光强度与多糖浓度的关系来确定所测灵芝多糖的含量在此， 我们用适量的苯酚和浓硫酸与多糖反应，多糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛 或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，这种化合物结构中带有苯环， 属于一种荧光物质，其荧光光谱见图6 ．1 ．b 图6 ．1 ．a 为苯酚与浓硫酸作用生成产物 的荧光光谱，为空白对照样，图6 ．1 ．b 为无水葡萄糖与适量的5 ％苯酚溶液、浓 硫酸反应后生成化合物的荧光光谱比较两个谱图，空白对照样的激发光谱谱峰 较宽，在3 0 0 —3 9 0D i l l 处，发射光谱谱峰在4 5 01 1 1 1 1 附近，而图6 ．1 ．b 中的激发光 4 7 广东工业大学硕士学位论文 谱主峰位置在4 8 0n l T l 处，发射光谱峰位置在5 1 0n m 处，两个谱图明显不同，可 以确定葡萄糖在浓硫酸作用下与苯酚反应生成了一种荧光物质所以，可以通过 荧光光谱法来测定多糖的含量 6 ．2 实验方法与结果 6 ．2 ．1 主要仪器 荧光分光光谱仪：L S ．5 5 型，P e r k i nE l m e r 公司，F l o u r 方式。

紫外．可见分光光度计：2 4 5 0 型，岛津( 苏州) 仪器公司生产 电子精密天平：奥豪斯国际贸易( 上海) 有限公司 6 ．2 ．2 试齐| J 及配制 无水葡萄糖，苯酚，浓硫酸，无水乙醇，均为A R 级 二次蒸馏水 5 ％苯酚溶液的制备：取A R 苯酚2 0g ，加铝片0 ．0 2g 和碳酸氢钠O ．0 1g ，常 压蒸馏，收集1 8 2 ℃的馏分，取此馏分5 ．0 0g ，加水溶解，定容至1 0 0 ．0 0m L ， 即得5 ％苯酚溶液将该溶液至于1 0 0m L 棕色瓶中，冷藏备用 硫酸葸酮溶液的制备：精密称取葸酮0 ．1 0g ，加8 0 ％硫酸溶液1 0 0m L 使溶 解，摇匀 葡萄糖溶液的制备：精密称取1 0 5 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖适量，加水配 置成不同浓度的葡萄糖溶液 6 ．2 ．3 测试样品 紫芝、黑芝、龙芝、赤芝、松杉灵芝、泰山灵芝，均为韶关学院英东生物工 程学院农业系提供 第六章荧光光谱法用于不同种灵芝中多糖含量的测定 6 ．2 ．4 实验最佳条件的确定 6 ．2 ．4 ．1 仪器测试条件的确定 根据预扫描的结果，经过多次试验，最终确定测试条件为： 激发光谱范围：3 2 0n ／i 1 。

5 0 0n n l ；最大激发波长：4 7 8n l n ；发射光谱范围： 4 9 0n n l 一7 0 0n l T l ，最大发射波长：5 1 0n l T l ；激发狭缝：5 ．0n l n ；发射狭缝：1 0 ．0n l T l ； 扫描速度：5 0 0n r n ／m i n 6 ．2 ．4 ．2 苯酚最佳用量的确定 量取1 ．5 0m g ／m L 葡萄糖溶液1 ．0 0m L5 份于2 0 ．0 0m L 具塞试管中，各加入 1 2 ．0 0m L 浓硫酸，然后再分别加入5 ％苯酚溶液0 ．1 1m L 、0 ．1 3m L 、O ．1 5m L 、 0 ．1 7m L 、O ．1 9m L 、0 ．2 1m L ，用二次蒸馏水定容至2 0 ．0 0m L ，迅速振摇混匀， 于室温下放置5 0m i n ，最后测定荧光光谱从图6 ．2 中，我们可以看出，当5 ％ 苯酚溶液的用量≥0 ．1 5m L 时，对应的荧光强度基本不变因此，选择5 ％苯酚溶 液的最佳用量为0 ．1 7m L 图6 - 25 ％苯酚溶液用量的影响 F i g ．6 —2E f f e c to fa m o u n to f5 ％p h e n o ls o l u t i o n 4 9 广东工业大学硕士学位论文 6 ．2 ．4 ．3 浓硫酸最佳用量的确定 量取1 ．5 0m g ／m L 葡萄糖溶液1 ．0 0m L5 份于2 0 ．0 0m L 具塞试管中，分别 加入浓硫酸6 ．0 0m L 、8 ．0 0m L 、1 0 ．0 0m L 、1 2 ．0 0m L 、1 4 ．0 0m L 、1 6 ．0 0m L ，然 后再各加入5 ％苯酚溶液0 ．1 7m L ，用二次蒸馏水定容至2 0 ．0 0m L ，迅速振摇均 匀，于室温下放置5 0m i n 。

最后测定荧光光谱从图6 ．3 中，我们可以看出，当 浓硫酸的用量 1 0 ．0 0m L 时，对应的荧光强度基本不变因此，选择浓硫酸的最 佳用量为1 2 ．0 0m L 图6 - 3 浓硫酸用量的影响 F i g ．6 - 3E f f e c to fa m o u n to fc o n c e n t r a t e ds u l f u r i ca c i d 6 ．2 ．4 ．4 最佳反应时间的确定 量取1 ．5 0m g ／m L 葡萄糖溶液1 ．0 0m L 于2 0 ．0 0m L 具塞试管中，加入1 2 ．0 0m L 浓硫酸，再加入O ．1 7m L5 ％苯酚溶液，用二次蒸馏水定容至2 0 ．0 0m L ，振摇均 匀分别静置3 0m i n 、4 0m i n 、5 0 m i n 、6 0m i n 、7 0m i n 、8 0m i n 后，测定荧光 从图6 ．4 可以看出，反应溶液在4 0 8 0m i n 内是稳定的，荧光强度几乎没有变化， 说明反应物稳定性很好为了实验的方便，我们选择静置5 0m i n 后开始测荧光 5 0 第六章荧光光谱法用于不同种灵芝中多糖含量的测定 图6 ．4 反应时间的影响 F i g ．6 - 4E f f e。