叶绿素的提取及理化性质的鉴定.doc

植物生理学实验叶绿体色索的提取分离及其理化性质摘要：本实验以新鲜的提収菠菜叶片为实验材料，対叶片中叶绿体中的色素进行了提収、分 离和理化性质的鉴定实验采用纸层析法进行分离,并从叶绿体色素的荧光现彖、皂化作用、 Mg2+的取代以及色素光谱对其理化性质进行了鉴定纸层析法分离色素的实验在滤纸上分 离出了 5条色索•带；荧光实验中在透射光下叶绿素提取液为蓝绿色，反射光下为紫红色； 造化反应中出现了明显的分层现彖；Mg2+的取代实验中颜色由蓝绿变为棕褐色，再变为墨 绿色，由上述实验可以鉴定叶绿体色素的理化性质一、 实验原理及实验目的实验原理：1、 提取：叶绿体中含有叶绿素（叶绿素a与b）和类胡萝卜素（胡萝卜素和叶黄素），这两类 色素均不溶于水，而溶于有机溶剂，故常用乙醇、丙酮等有机溶剂提取2、 分离：当溶剂沿支持物不断向前推进时，由于叶绿体中不同色素分子结构不同，在两 相（流动相与固定相）间具有不同的分配系数，因此它们移动速率不同对叶绿体色素进行层 析可将不同色素分离3、 理化性质的观察：叶绿素是一种二竣酸酯，在碱作用下，发生皂化反应；在弱酸作用 下，叶绿素中镁可被氮原子取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿 素，叶绿素具有荧光，故从■入射光相垂直的方向观察叶绿素溶液呈血红色。

叶绿素的化学 性质不稳定，易受强光氧化，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快分子吸收光能后，从基态转变到激发态叶绿索分子有两种单线激发态，对应两个主要的 光吸收区分子在激发态停留的吋间不超过数纳秒（IO®秒）由激发态回到基态的过程称为衰变（Decay）叶绿素 a： C55H72O5N4Mg, MW=893.4891叶绿素 b： C55H7（）O6N4Mg, MW=907.4727胡萝卜素：C4oH56， MW= 536.8726叶黄素：C4（）H56O2, MW=568.8714实验冃的：以植物叶片组织为材料，提取叶绿体色素;以纸层析法分离其成分;鉴定叶绿体色素的理化 性质.二、 实验材料和方法1、 实验材料：菠菜2、 实验用具：天平、研钵、三角漏斗、滤纸、层析缸、毛细管、分光镜、量筒、烧杯、试 管等3、 实验试剂：丙酮、碳酸钙、层析液（石油懸丙酮=25： 3）, 20%KOH・甲醇、乙醛、l%HCk 醋酸铜三、 实验步骤1、叶绿体色素的提取（1） 取新鲜菠菜叶片2克，擦干，去中脉，剪碎放入研钵；（2） 加入少许石英砂和CaCC）3,再加入无水I人j酮10ml,研磨成匀浆，再加I人j酮15ml;(3) 用漏斗滤去残渣,得叶绿体色素提取液(置于暗处).2、 纸层析分离叶绿体色索(1) 层析样纸制备，将优质滤纸剪成3cmx9cm的长条，将一端明成中央留约lcmx().5cm的窄 条；(2) 点样，用细玻璃棒蘸取叶绿体色素提取液点于层析纸的窄条上端中央部，用吹风机吹干后 在原处重复点样7-8次；(3) 展层，在层析缸中加入3-5ml层析推动液,然后将已点样的层析纸插入缸的側壁槽内，调 节纸条使窄条1/2部分浸入推动液中，盖好盖子，于阴暗处展层约lOmin,即可在层析纸上分辨 出4种不同的清楚色层；3、 叶绿体理化性质的观察荧光现象的观察：取浓的叶绿体色素提取液化3ml,在透射光和反射光下观察叶绿体色素提 取液的颜色。

皂化作用：在观察过荧光现彖的叶绿体色素提取液中加入2ml的2()%KOH-甲醇溶液,充分混 匀•吹打5分钟;沿试管壁缓慢加入3ml乙瞇+4ml的蒸镉水,边滴加边摇动，肓至看到溶液逐渐 分为两层为止.对照不加KOH-甲醇溶液叶绿素分子中的取代作用：取2只试管，分别加入2ml叶绿体色索提取液，第1只作为对 照，第2只加入数滴5%HC1,摇匀，观察溶液颜色变化•当溶液变褐后,再加入少量醋酸铜粉末, 并微加热.与対照比较，观察溶液颜色变化，并解释原因四、实验结果与讨论1、纸层析分离叶绿体色索实验中，用铅笔在层析纸上指出4种色层的轮聊，并注明色层的名称 和颜色2、观察荧光现彖的实验中，在透射光和反射光下观察叶绿体色素提取液的颜色.说明颜色有 何不同并解释原因答：现彖：在透射光下叶绿素提取液为蓝绿色，在反射光下为紫红色原因：叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变 冋到基态时可发射出红光量子，因而产牛荧光，故从与入射光相垂直的方向观察叶绿 素溶液呈紫红色：透射光呈蓝绿色是因为叶绿素主要吸收白然光中的红橙光和蓝紫光, 対蓝绿色光的吸收很少，而対于-其他颜色光的吸收很多，所以会呈现出蓝绿色的反射 光。

3、 皂化反应中，说明上下各层液所含色素种类答：试管中溶液岀现明显的分层现象，上层显黄色，下层显绿色，底部有明显的乳口色 沉淀原因：上层溶液溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素，下层溶液溶有皂化的叶绿素a 和叶绿索b及少虽的叶黄索底部的乳白色沉淀是叶绿体色索提取液中某些成分与碱发 生了化学反应的产物4、 叶绿体色索提取液中分别加入5%HCI和醋酸铜粉末，观察溶液颜色变化，并解释原因答：现象：加入5%HC1后溶液变为棕褐色，加入醋酸铜粉末并微微加热后溶液由褐绿色 慢慢变深，最后变为墨绿色原因：在弱酸作用下，叶绿素中镁可被氢原子取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇 铜则成为绿色的铜代叶绿素5、 研磨提取色素时加入CaCO3冇什么作用？答：在研磨过程中，会产生有机酸，电离出氢离了，会取代叶绿素中的镁离了，形成去 钱叶绿索，无色，加碳酸钙就是为了和冇机酸作用，减少氢离了，防止叶绿索被破坏6、 哪些条件会影响实验结果？答：（1）色索的捉取与分离过程中由于见光情况比较严重，导致实验最后的结果有谋差 （2）研磨绿叶至细而匀的程度和研磨过程的速度；参考文献：王英典，刘宇.植物生物学实验指导•北京：高等教育出版社.（第2版）。