限制性酶切与连接.ppt

实验十 限制性酶切与连接 一种能够结合外源DNA 片段形成重组DNA，并能进行自我复制的DNA 分子称为Vectors主要载体：质粒、噬菌体、病毒功能：克隆载体（构建基因组文库或cDNA 文库）、测序载体、表达载体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒 随着生物技术的发展和科学研究的深入，不断出现具有不同功能的新载体，如可以容纳几百万碱基的酵母人工染色体载体（Vectors）如何构建所需要的载体？如何构建所需要的载体？酶切酶切 连接等技术连接等技术一、一、DNADNA的限制性酶切实验原理的限制性酶切实验原理n核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，功能犹似高等功物免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ侵袭n限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨn根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类n第一类（I型）限制性内切酶能识别专一核苷酸顺序，在识别位点很远的地方任意切割DNA链，切割核苷酸顺序没有专一性，随机这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。

这类酶如EcoB、EcoK等n第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链但这几个核苷酸对也不是特异性的因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端因此也不能应用于基因克隆1. 限制性内切酶的类型限制性内切酶的类型n第二类（Ⅱ型）限制性内切酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶.n 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段； nⅡ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； nⅡ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出、３’端突出和平末端n限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展1. 限制性内切酶的类型限制性内切酶的类型粘性末端粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G| |AATTC ……3’ 3’…… CTTAA| |G …… 5’在双链上交错切割的位置切割后生成 5’……G AATTC……3’ 3’……CTTAA G……5’各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。

II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT| |ATC …… 3’3’…… CTA| |TAG …… 5’ 　切割后形成5’…… GAT ATC …… 3’3’…… CTA TAG …… 5’ 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来平头末端：平头末端：限制性内限制性内切酶切酶酶分子酶分子识别位点识别位点切割位点切割位点 限制作用限制作用是否需用是否需用 ATPⅠ类类 三三亚亚基基双双功能酶功能酶 二二 分分 非非 对对称称至至 少少 在在 识识别别位位点点外外 1000bpYesⅡ类类内内 切切 酶酶 与与甲甲 基基 化化 酶酶分分 子子 不不 在在一起一起4-6bp, 大大多多 数数 为为 回回文文 对对 称称 结结构构 在在 识识 别别 位位点点 中中 或或 靠靠近近 识识 别别 位位点点 无无 特特 异异性性NoⅢ类类二二 亚亚 基基 双双功能酶功能酶 5-7 bp 非非对称对称在在 识识 别别 位位点点下下游游 24-26bpYesv用用属属名名的的头头一一个个字字母母和和种种名名的的头头两两个个字字母母表表示示寄寄主主菌菌的的物物种种名名称称，，如如E. E. colicoli 用用EcoEco表表示示，，所所以以用用斜斜体字。

体字v用用 一一 个个 字字 母母 代代 表表 菌菌 株株 或或 型型 ，， 如如 流流 感感 嗜嗜 血血 菌菌( (HeamophilusHeamophilus influenzaeinfluenzae)Rd)Rd菌株用菌株用d d，即，即HinHind dv如如果果一一种种特特殊殊的的寄寄主主菌菌株株，，具具有有几几个个不不同同的的限限制制与与修修饰饰酶酶，，则则以以罗罗马马数数字字表表示示，，如如HinHindⅠ, dⅠ, HinHindⅡdⅡ，，HinHindⅢdⅢ等2. 2. 限制性核酸内切酶的命名法限制性核酸内切酶的命名法由由 pUC18 pUC18改造而来，大小为改造而来，大小为 3162bp 3162bp 相当于在相当于在 pUC18 pUC18中增加了带有中增加了带有 M13 M13 噬菌体噬菌体 DNA DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列１．内切酶：１．内切酶：n不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；n 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；n内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常 1u1u指在适当条件下，指在适当条件下，1 1小时内完全酶解１小时内完全酶解１ugug特定ＤＮＡ底物特定ＤＮＡ底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ugug DNA DNA对２－对２－３３u u酶短时间为宜。

酶短时间为宜n同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力；５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力；n 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染对内切酶的污染注意事项注意事项注意事项注意事项————限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切n作为内切酶底物，ＤＮＡ应该具备一定的纯度，其溶液中不作为内切酶底物，ＤＮＡ应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、能含酚、氯仿、乙醚、SDSSDS、、EDTAEDTA、、高盐浓度、酒精等，这高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力n这种抑制可通过：这种抑制可通过： 增加酶作用单位数（增加酶作用单位数（10~20U/ug DNA10~20U/ug DNA）、）、 增大反应体积以稀释可能的抑制剂增大反应体积以稀释可能的抑制剂 或延长反应时间加以克服。

或延长反应时间加以克服五、注意事项五、注意事项五、注意事项五、注意事项————限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切２．ＤＮＡ：２．ＤＮＡ：n反应缓冲液主要由反应缓冲液主要由Tris·HClTris·HCl、、NaClNaCl、、Mg2Mg2+ +组成，其中组成，其中Mg2Mg2+ +为内切酶辅基；为内切酶辅基；nTris·HClTris·HCl维持反应体系维持反应体系pHpH值在值在7.2-7.67.2-7.6之间；之间；nNaClNaCl浓度不同形成３种级别的离子强度：浓度不同形成３种级别的离子强度： 低盐（低盐（10mM 10mM NaClNaCl) ) 中盐（中盐（50mM 50mM NaClNaCl）） 高盐（高盐（100mM 100mM NaClNaCl））n 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液不同的内切酶选择特定的反应缓冲液五、注意事项五、注意事项五、注意事项五、注意事项————限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切３．反应缓冲液：３．反应缓冲液：连接反应连接反应连接反应连接反应------连接酶（连接酶（连接酶（连接酶（ligase））））ligase　　又称合成酶，能催化两个分子连接成一个分子或把一个分子的首尾相连接的酶。

此反应与ATP的分解反应相偶联在把两分子相连接的同时发生三磷酸腺苷（ATP)的高能磷酸键的断裂如DNA连接酶等 连接酶的催化反应过程需要Mg离子  T4 DNA 连接酶催化双链DNA相邻核苷酸的5´-磷酸和3´-羟基之间的连接，平端和粘端都可被连接本酶也能催化RNA 连接到 DNA 或者双链RNA 上，但不催化单链核酸的连接 把一个片段克隆到质粒载体时，采用1:1, 1:3或 3:1 的载体:插入片段摩尔比 连接反应连接反应连接反应连接反应---T4---T4连接酶连接酶连接酶连接酶反应体系：反应体系：载体载体 DNA 100ng插入片段插入片段DNA 17ng连接酶连接酶 10X 缓冲液缓冲液 1μlT4 DNA 连接酶连接酶 (Weiss 单位单位) 0.1–1u无核酸酶水加至无核酸酶水加至 10ul2. 孵育反应于：室温下孵育反应于：室温下3 小时，或小时，或4°C 过夜，或过夜，或15°C，，4–18 小时实验步骤与试剂（酶切）实验步骤与试剂（酶切）实验步骤与试剂（酶切）实验步骤与试剂（酶切）1. 1.质粒质粒pUC18 DNApUC18 DNA2.2.PCRPCR产物产物3.3.HindⅢHindⅢ内切酶内切酶4.4.Hind Hind ⅢⅢ 10 X buffer5.ddH2O实验步骤与试剂实验步骤与试剂实验步骤与试剂实验步骤与试剂反应体系反应体系1. 1.质粒质粒pUC18 DNA 2μ lpUC18 DNA 2μ l2.2.PCRPCR产物产物 2μ l2μ l3.3.HindⅢHindⅢ内切酶内切酶 2μ l2μ l4.4.Hind Hind ⅢⅢ 10 X buffer 2μ l2μ l5.ddH2O 1 12μ l2μ l总体系为总体系为20 μ l20 μ l，混匀，混匀反应步骤反应步骤1. 1.37°C 37°C 酶切酶切2h2h（各位老师上课只要求（各位老师上课只要求1h1h，自，自己改一下）己改一下）2.2.65°C 65°C 灭活灭活10min10min3.3.琼脂糖电泳检测琼脂糖电泳检测1. 1.内切酶失活内切酶失活2.2.DNADNA不纯，含有不纯，含有SDSSDS，，酚，酚，EDTAEDTA等内切酶抑制因子等内切酶抑制因子3.3.条件不适（试剂、温度）条件不适（试剂、温度）4.4.DNADNA酶切位点上的碱基被酶切位点上的碱基被甲基化甲基化5.5.DNADNA酶切位点上没有甲基酶切位点上没有甲基化（如化（如DpnDpn I I））6.6.DNADNA位点上存在其它修饰位点上存在其它修饰7.7.DNADNA不存在该酶识别顺序不存在该酶识别顺序1. 1.标准底物检测酶活性标准底物检测酶活性2.2.将将DNADNA过柱纯化，乙醇沉淀过柱纯化，乙醇沉淀DNADNA3.3.检查反应系统是否最佳检查反应系统是否最佳4.4.换用对换用对DNADNA甲基化不敏感的同裂甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒酶酶解，重新将质粒DNADNA转化至转化至dcmdcm- -，，dam-dam-基因型的细菌菌株基因型的细菌菌株5.5.换用不同切割非甲基化位点的同裂换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化酶消化DNADNA（如（如San3A ISan3A I代替代替DpnDpn I) I)，，重新将质粒转至重新将质粒转至dcmdcm+ dam++ dam+菌菌株中扩增株中扩增6.6.将将DNADNA底物与底物与λDANλDAN混匀进行切混匀进行切割验证割验证7.7.换用其它的酶切割换用其它的酶切割DNADNA或过量酶或过量酶消化进行验证消化进行验证限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切常见问题分析常见问题分析常见问题分析常见问题分析q问题一：问题一：DNADNA完全没有被内切酶切割完全没有被内切酶切割 原原因因对对策策1. 1.内切酶活性下降内切酶活性下降2.2.内切酶稀释不正确内切酶稀释不正确3.3.DNADNA不纯，反应条件不佳不纯，反应条件不佳4.4.内切酶识别的内切酶识别的DNADNA位点上的碱位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰基被甲基化或存在其它修饰5.5.部分部分DNADNA溶液粘在管壁上溶液粘在管壁上6.6.内切酶溶液粘度大，取样不准内切酶溶液粘度大，取样不准7.7.酶切后酶切后DNADNA粘末端退火粘末端退火8.8.由于反应溶液、温度、强烈振由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性荡使内切酶变性9.9.过度稀释使酶活性降低过度稀释使酶活性降低10.10.反应条件不适反应条件不适11.11.识别位点两侧插入了可影响酶识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序切效率的核酸顺序1. 1.用用5-105-10倍量过量消化倍量过量消化2.2.用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶3.3.同上同上4.4.同上同上5.5.反应前离心数秒反应前离心数秒6.6.将内切酶稀释，增大取样体积将内切酶稀释，增大取样体积7.7.电泳前将样品置电泳前将样品置65℃65℃保温保温5-105-10分分钟，取出后置冰浴骤冷钟，取出后置冰浴骤冷8.8.使用标准反应缓冲液及温度，避使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡免强烈振荡9.9.适当稀释酶液，反应液稀释的酶适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏不能贮藏10.10.使用最佳反应体系使用最佳反应体系11.11.加大酶量加大酶量5-105-10倍倍q问题二：问题二：DNADNA切割不完全切割不完全 原原因因对对策策限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析1. 1.内切酶星状活性内切酶星状活性2.2.其它内切酶污染其它内切酶污染3.3.底物中含其它底物中含其它DNADNA杂质杂质1. 1.检查反应条件：甘油浓度大于检查反应条件：甘油浓度大于12%12%，盐度过低，，盐度过低，Mn2+Mn2+的存在及酶：的存在及酶：DNADNA值过大均均可导致星状活性，值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量降低酶的用量2.2.用用λDNAλDNA作底物检查酶切结果作底物检查酶切结果3.3.电泳检查电泳检查DNADNA，，换用其它酶切，换用其它酶切，纯化纯化DNADNA片段片段q问题三：问题三：DNADNA片段数目多于理论值片段数目多于理论值 原原因因对对策策限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析1. 1.DNADNA定量错误（如定量错误（如RNARNA含量较高）含量较高）2.2.在酶切反应液中形成非在酶切反应液中形成非特异的沉淀特异的沉淀1. 1.用用RNARNA酶酶A A（无（无DNADNA酶）酶）100ug/ml100ug/ml消化消化DNADNA样，酚抽提样，酚抽提后沉淀溶解，定量后沉淀溶解，定量2.2.在反应前透析在反应前透析DNADNA样品或用酒精样品或用酒精沉淀二次沉淀二次q问题四：酶切后没有观察到问题四：酶切后没有观察到DNADNA片段的存在片段的存在 原原因因对对策策限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析1. 1.保存温度不合适保存温度不合适2.2.以稀释形式保存以稀释形式保存3.3.贮藏缓冲液不适当贮藏缓冲液不适当4.4.低蛋白浓度低蛋白浓度1. 1.内切酶贮藏在含内切酶贮藏在含50%50%甘油的甘油的贮藏液中，应在贮藏液中，应在-20℃-20℃低温保低温保存存2.2.稀释酶液不宜长期存放，应一稀释酶液不宜长期存放，应一次使用次使用3.3.使用厂家推荐的贮藏缓冲液使用厂家推荐的贮藏缓冲液4.4.内切酶与内切酶与500ug/ml500ug/ml的的BSABSA一起一起保存保存q问题五：内切酶保存期内快速失活问题五：内切酶保存期内快速失活 原原因因对对策策限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析1. 1.DNADNA上结合有蛋白质上结合有蛋白质2.2.内切酶中含有内切酶中含有DNADNA外外切酶切酶1. 1.减少酶用量或消化时间，换减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶用新包装的酶2.2.减少酶用量或消化时间，换减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶用新包装的酶q问题六：电泳后问题六：电泳后DNADNA片段的带型弥散，不均一片段的带型弥散，不均一 原原因因对对策策DNADNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析1. 1.含磷酸盐的浓度高含磷酸盐的浓度高2.2.内切酶失活不全或含有内切酶失活不全或含有ATPATP酶酶3.3.平末端连接平末端连接4.4.外切酶污染外切酶污染5.5.连接缓冲液不合适连接缓冲液不合适1. 1.透析，乙醇沉淀去除磷酸盐透析，乙醇沉淀去除磷酸盐2.2.延长灭活时间或用酚抽提，乙延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收醇沉淀回收DNADNA3.3.加大加大T4 DNA T4 DNA LigaseLigase用量用量4.4.减少酶用量，缩短保温时间，减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收酚抽提回收DNADNA5.5.重新配制连接缓冲液重新配制连接缓冲液DNADNADNADNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析电泳常见问题分析电泳常见问题分析q问题七问题七：：酶切后的酶切后的DNADNA片段连接效率低片段连接效率低 原原因因对对策策1. 1.DNADNA降解降解2.2.电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液陈旧3.3.所用电泳条件不合适所用电泳条件不合适4.4.DNADNA上样量过多上样量过多5.5.DNADNA样含盐过高样含盐过高6.6.有蛋白污染有蛋白污染7.7.DNADNA变性变性1. 1.避免核酸酶污染避免核酸酶污染2.2.电泳缓冲液多次使用后，离子强度电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，降低，pHpH值上升，缓冲能力减弱，值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。

建议经常更换从而影响电泳效果建议经常更换电泳缓冲液电泳缓冲液3.3.电泳时电压不应超过电泳时电压不应超过20V/cm20V/cm，，温温度＜度＜30℃30℃；巨大；巨大DNADNA链电泳，温链电泳，温度应＜度应＜15℃15℃；核查所用电泳缓冲液；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力是否有足够的缓冲能力4.4.减少凝胶中减少凝胶中DNADNA上样量上样量5.5.电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐6.6.电泳前酚抽提去除蛋白电泳前酚抽提去除蛋白7.7.电泳前勿加热，用电泳前勿加热，用20mM 20mM NaClNaCl缓缓冲液稀释冲液稀释DNADNADNADNADNADNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析电泳常见问题分析电泳常见问题分析q问题一：问题一：DNADNA带模糊带模糊 原原因因对对策策1. 1.对于对于λ/λ/HinHind IIId III片段片段coscos位位点复性点复性2.2.电泳条件不合适电泳条件不合适3.3.DNADNA变性变性1. 1.电泳前于电泳前于65℃65℃加热加热DNA 5DNA 5分钟，然分钟，然后在冰上冷却后在冰上冷却5 5分钟分钟2.2.电泳电压不超过电泳电压不超过20V/cm20V/cm；；温度＜温度＜30℃30℃；经常更换电泳缓冲液；经常更换电泳缓冲液3.3.以以20mM 20mM NaClNaCl Buffer Buffer稀释稀释DNADNA，，电电泳前勿加热泳前勿加热q问题二：问题二：不规则不规则DNADNA带迁移带迁移对对策策 原原因因DNADNADNADNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析电泳常见问题分析电泳常见问题分析1. 1.DNADNA的上样量不够的上样量不够2.2.DNADNA降解降解3.3.DNADNA走出凝胶走出凝胶4.4.对于对于EBEB染色的染色的DNADNA，，所所用光源不合适用光源不合适1. 1.增加增加DNADNA的上样量；聚丙烯酰胺凝的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低上样量可适当降低2.2.避免避免DNADNA的核酸酶污染的核酸酶污染3.3.缩短电泳时间，降低电压，增强凝缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度胶浓度4.4.应用短波长（应用短波长（254nm254nm））的紫外光源的紫外光源q问题三：问题三：带弱或无带弱或无DNADNA带带对对策策 原原因因DNADNADNADNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析电泳常见问题分析电泳常见问题分析1. 1.小小DNADNA带走出凝胶带走出凝胶2.2.分子大小相近的分子大小相近的DNADNA带带不易分辨不易分辨3.3.DNA DNA 变性变性4.4.DNADNA链巨大，常规凝胶链巨大，常规凝胶电泳不合适电泳不合适1. 1.缩短电泳时间，降低电压，增强凝缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度胶浓度2.2.增加电泳时间，核准正确的凝胶浓增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度度3.3.电泳前请勿高温加热电泳前请勿高温加热DNADNA链，以链，以20mM 20mM NaClNaCl Buffer Buffer稀释稀释DNADNA4.4.在脉冲凝胶电泳上分析在脉冲凝胶电泳上分析q问题四：问题四：DNADNA带缺失带缺失对对策策 原原因因DNADNADNADNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析电泳常见问题分析电泳常见问题分析。