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植物转基因技术及其应用作者：薛菲 孙春玉 蒋世翠 王康宇 于洋 王义 张美萍 来源：《吉林蔬菜》 2014年第5期薛 菲 孙春玉 蒋世翠 王康宇 于 洋 王 义 张美萍（吉林农业大学生命科学学院吉林•长春130118）摘 要：本文综述了五种重要的植物遗传转化方法（农杆菌介导法，聚乙二醇法，基因枪法 花粉通道法和电激穿孔法）及其应用，并阐述了植物转基因技术在抗除草剂，抗逆性和品质改 良等方面的研究进展关键词：转基因技术；应用；研究进展20世纪70年代末，关于转基因植物的研究开始出现，当时研究人员利用野生型Ri和Ti 质粒对细胞进行转化，只在一小部分植物（如烟草、马铃薯）上成功再生出转基因植株［1,2］ 三十年来，随着科学家对高等植物组织培养技术和基因重组技术的深入研究以及这些技术的快 速发展，植物转基因技术应运而生转基因技术，也被称为基因工程，植物基因工程是现代植 物生物技术的研究核心它是按照人们的意愿将外源DNA （基因）重组到受体细胞基因组中并 使之得到特异性表达利用植物基因工程能够克服植物远缘杂交的不亲和障碍，扩大物种杂交 的范围，加快变异速度，提供了定向创造生物的可能性因此，转基因技术是改良品种，开发 高产、优质、高效兼抗性作物新类型和新品种的重要途径。

1983年，比利时科学家Montague和美国Fraley等人将新霉素磷酸转移酶（NPT）基因通 过农杆菌Ti质粒载体转入烟草细胞，得到了抗卡那霉素的烟草愈伤组织，并成功获得世界上首 株抗病毒转基因烟草，这标志着人类希望通过转基因技术对植物品质进行改造，将抗除草剂基 因、抗病基因、抗虫基因、抗环境胁迫性状基因和特殊蛋白基因等有益基因转化到农作物中， 使之获得所需的优良遗传性状成为可能迄今为止已经成功培育出转基因烟草，水稻，番茄， 棉花，大豆，玉米和矮牵牛等转基因植物近200种，植物转基因技术在作物改良和作物育种等 研究方面有着至关重要的作用本文介绍了几种常用且有效的植物遗传转化方法，以及植物转 基因技术的应用和展望1 植物转基因技术的方法植物转基因技术根据转化过程中是否需要载体，可划分为两大类：直接导入技术和间接导 入技术直接导入技术即是不依赖其他载体，直接将经过一些特殊处理的裸露DNA导入到植物 细胞或原生质体中来实现转化的直接导入技术主要采用的方法是化学方法（聚乙二醇介导法） 和物理方法（如基因枪法、花粉管通道法、电激穿孔法、显微注射法以及超声波导入法等）间接导入技术主要是将外源基因插入到农杆菌的质粒上或是病毒载体的DNA 上，再通过载体将 外源基因重组到植物细胞基因组中，其方法主要有农杆菌介导法和植物病毒介导法。

目前，农 杆菌介导法，基因枪法，聚乙二醇（PEG ）介导法，电激穿孔法和花粉管通道法是在植物遗传转 化中广泛应用的几种方法1.1 农杆菌介导法农杆菌介导法是先将插入目的基因的植物表达载体转入农杆菌中，然后通过农杆菌侵染植 物，将根癌农杆菌的Ti质粒或发根农杆菌的Ri质粒上的目的基因导入植物受体细胞并整合到 其基因组中，从而完成目的基因的转化农杆菌介导法是目前为止应用最早，研究最深入，应 用最广泛，技术相对成熟、有效的转基因方法自1983年首次运用农杆菌介导法获得转基因植 物以来，研究人员相继利用该方法获得了番茄，牵牛花和油菜等转基因植株，迄今全球有超过 80%的转基因植物是利用农杆菌介导法转化成功的1985年Horsh等创立了叶盘转化法，它是 利用根癌农杆菌侵染植物外植体（植物组织、幼苗）后与之共培养来实现转化的转基因系统， 该方法简单有效，广泛应用于双子叶植物的遗传转化［3,4］长期以来农杆菌介导法仅限于双子 叶植物的遗传转化，直至近年研究表明，酚类物质（如乙酰丁香酮）可促进农杆菌吸附在植物 细胞和幼苗上，以此提高转化率因而通过在转化过程中加入信号传导物质成为农杆菌介导法 在用于单子叶植物的遗传转化上的重要突破［5,6］，一些主要单子叶植物如水稻［7］、玉米［8］和 大麦［9］均通过农杆菌介导法成功得到了转基因植株。

与其他方法相比，农杆菌介导法有着明显 的优势［10］，该方法操作简便，所需费用低，可用于转化相对较大的DNA片段，能更有效地产 生单位点整合，不易产生基因沉默，能够稳定遗传，而且转化率和重复性较好，并能得到可育 的转基因植株但此方法的缺点是在转化过程中很难掌握材料的抑菌程度且转化过程会出现左 边界丢失现象等［11］1.2 基因枪法1987年，美国康奈尔大学生物化学系的Sanford首次提出基因枪法［12］，也称为粒子 枪法、高速微弹法、微弹轰击法其原理是用钨粉或金粉等金属微粒包裹外源DNA，利用高压 放电或高压气体作为驱动力使金属微粒高速运动击入受体细胞或组织中，从而将外源目的基因 整合到植物基因组中并培育出转基因植株同年Klein等首次利用基因法成功得到了转基因玉 米目前，有很多植物通过基因枪技法转化成功，如棉花［13］、水稻［14］、玉米［15］、小麦［16］、大豆［17］、土豆［18］等，它对于难再生植物的遗传转化更为实用基因枪方法的优点是 操作简单、转化时间短、对靶细胞及受体材料来源没有严格要求、还能使外源基因转化线粒体 和叶绿体，使转化细胞器成为可能［19］其缺点是转化植物整合位点不定、拷贝数多、嵌合体 多、容易发生共抑制和基因沉默现象、所用仪器昂贵且转化效率低。

1.3 聚乙二醇介导法聚乙二醇（PEG）是植物遗传转化最常用的化学诱导剂1980年Dayey等首次建立了聚乙 二醇法它的原理是在高pH条件下的PEG与原生质体融合，原生质体膜的通透性发生改变，加 强了原生质对外源DNA的吸收，使目的基因整合到原生质体的基因组上并使之发生特异表达 1982年Krens［20］等进一步发展了这种通过PEG介导转化原生质体的转化体系1988年Zhang 等通过聚乙二醇法将GUS基因成功的转入水稻的原生质体中，并获得了第一批转基因水稻此 后，该方法也先后成功转化了小麦，水稻，高梁，油菜和大豆等植物［20］聚乙二醇法的优点 是对细胞的副作用小，转化的稳定性、重复性好，并能实现一次转化多个原生质体，由于转基 因植株来自同一细胞，因而能有效避免嵌合转化体的产生它的缺点是转化率较低（一般为 10-5~10-6），因为PEG对原生质体有毒害作用，所以该方法不能用于原生质体培养，也不能用 于再生困难的植物1.4 花粉管通道法1983年科学家周光宇通过研究我国远缘杂交提出了 DNA片段杂交的假设［21］，为花粉通道 法提供了理论基础，并首次通过花粉管通道法将海岛棉基因转入陆地棉，并培育出抗枯萎病棉 花新品种［22］。

花粉管通道法是在植物授粉后的特殊时期，利用在植物开花过程中萌发的花粉 管通道，将外源DNA导入受精卵，进而使目的基因整合到受体植物基因组中，使其自然发育成 种子并形成转基因植株利用花粉管通道法已成功转化了棉花、水稻和小麦等农作物［23］，培 育出许多有抗逆性和优良品质的新品种该方法的优点是不需要组培再生过程，操作技术简单， 对外源基因、受体植物种类和仪器设备要求不高，育种周期短缺点是在转化过程中容易受植 物本身和外界影响、转化效率低、可重复性差1.5 电激穿孔法电激穿孔法的原理是当植物细胞受到外界高压电击时，细胞膜会出现非对称穿孔，但这种 开放小孔的出现是具有可逆性，解除电击后这些小孔会关闭，所以在此期间要利用这种小孔成 为外源基因导入细胞的通道，从而使目的基因导入并整合到受体细胞的基因组上1985年 Michael等人首次利用电激穿孔法，在1400 V的高压条件下处理细胞质膜，使外源基因导入， 在培养2~4天后的原生质体中检测到外源基因的瞬时表达［25］此后，电激穿孔法相继成功的 应用于烟草、番茄、玉米、水稻、大豆、小麦和马铃薯等植物原生质体的转化该方法优点是 对受体材料来源广泛，操作简便。

缺点是转化率低2 植物转基因技术的应用通过基因工程技术来改变植物基因特性，可以培育出人类需要的具有抗除草剂、抗虫害、 抗病或者抗寒、抗旱、抗盐碱等具有优良品质的植物新品种和新品系1986年首次批准转基因 作物进入田间试验，之后近三十年里转基因作物研究迅速发展，直至今天全球有30个国家被批 准种植转基因作物，种植总面积达到1.7亿hm2，植物种植类达40余种转基因技术在全球迅 速发展的同时，在我国也得到较快的发展我国在棉花、水稻、玉米、大豆和小麦等作物转基 因的研究上获得了可喜的成果2.1 抗除草剂目前，抗除草剂植物的种植面积约占转基因植物种植总面积的59%，是全球种植面积最大 的一类转基因植物［26］抗除草剂的种类主要有草铵膦、草甘膦、2,4-D，咪唑啉酮和磺酰脲类 高浓度的2,4-D也是一种有效除草剂，1994年我国获得的第一株转基因抗除草剂棉花就是通过 2,4-D单氧化酶基因导入棉花中，并获得可遗传植株1994年，由抗溴苯腈作为选择标记基因 的转基因棉花开始用于种植 1996年到1998年，抗草甘膦的转基因大豆，棉花，玉米以及抗 草铵膦的油菜，棉花，玉米也陆续进入大面积种植抗除草剂植物的广泛种植，有效的节约了 劳动力，大幅度提高了农业生产效率。

2.2 抗逆性植物生长过程中会遇到很多的生物非生物胁迫，主要有虫害，病害，干旱，盐碱和极端温 度等因此我们要通过转基因技术来提高植物的抗逆水平最早应用的抗虫基因是苏云金杆菌毒蛋白基因（Bt）1987年比利时科学家将Bt基因转 入烟草细胞，获得抗虫转基因烟草同年，我国利用农杆菌介导法，首次将Bt基因转入番茄和 烟草中，并成功得到相应的可遗传的抗虫转基因植株此后又成功的将Bt基因相继转入玉米、 茄子和棉花等植物Bt转基因植物的细菌内毒素只是对特定的害虫（鳞翅目昆虫）有较高的毒 害作用，对人和非目标昆虫几乎没有毒性［27］，但Bt基因的抗虫谱较窄，昆虫对其容易产生耐 受性目前除了 Bt基因，常用的抗虫基因还有蛋白酶抑制剂基因（PI）、淀粉酶抑制剂基因、 外源凝集素基因、蝎毒素基因和蜘蛛素基因等目前抗病转基因植物的种植面积远远低于抗除草剂和抗虫转基因植物的种植面积［28］它 主要是通过向植物中转入抗菌肽、几丁质酶和防御素来提高植物的抗病能力基因抗病毒转基 因的分子机制主要有抑制病毒增殖，阻止病毒移动，RNA沉默介导三种机制最常用、有效的 方法就是利用RNA沉默介导实现植物的抗病能力的提高，利用该方法成功获得了具有明显抗病 性的玉米［29］、大豆［30］、番茄［31］和大麦［32］等转基因植物。

除了以上的抗性转基因研究外，在抗寒、抗旱和耐盐碱等抗环境胁迫方面的转基因研究也 有很大进展目前，已有报道将抗冻蛋白、热击蛋白成功转入玉米［33］、烟草［34］和番茄[35,36]中，获得相应的抗寒转基因植物，提高了它们的抗寒能力通过向玉米中转入6-磷酸 海藻合成酶基因，来提高玉米的抗旱能力也有研究表明，利用甜菜碱醛脱氢酶基因转化马铃 薯[37]，花生、[38]、棉花[39]、胡萝卜[40]，转基因植株仍能在NaCl胁迫条件下生长良好2.3 品质改良方面利用转基因技术进行品质改良主要目的是提高作物产品质量和营养价值目前应用于作物 产品质量改良的基因主要有：控制果实成熟的基因、谷物种子贮藏蛋白基因、控制脂肪合成基 因等我国研究人员已成功将高赖氨酸基因整合到玉米基因组上，获得转基因植株中赖氨酸含 量提高了10%以上获得的延熟转基因番茄的储藏时间通常延长1~2个月，最高延熟时间甚至 超过80天[41]瑞士 Potrykus等将类胡萝卜素的相关合成基因成功转入水稻，培育出有类胡 萝卜素的水稻，提高其营养价值3 植物转基因技术的应用前景植物转基因技术是以分子生物学为研究手段，对目的基因进行人工分离、修饰和转移，通 过导入基因再表达，来赋予植物新的优良性状从。