2021年检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术.docx

精品word学习资料可编辑一，检测蛋白质与蛋白质相互作用① 技术（ ）， ，即荧光共振能量转移技术；该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示：以下图为例，如要利用检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白；然后只需用紫外光对进行激发，并检测是否放出绿色荧光；假如能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，就是这两种蛋白没有相互作用；|精.|品.|可.|编.|辑.|学.|习.|资.|料.② 酵母双，三杂交技术（ ）酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如 4，4 等都含有二个不同的结构域，即和；这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录；由此，设计不同的两个载体，一个含有基因（假设为 A 载体），另一个含有基因（假设为 B 载体）；一般将一个已知蛋白的基因连在 B 载体上，作为诱饵 ()，将未知蛋白的基因连在 A 载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用；假如两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；假如两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示：名师归纳总结——欢迎下载精品word学习资料可编辑由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用， 因此又进展出了分别泛素酵母双杂交系统；该系统的原理如下图所示：名师归纳总结——欢迎下载精品word学习资料可编辑|精.|品.|可.|编.|辑.|学.|习.|资.|料.如以下图，将泛素蛋白拆分为两个片段，即 C 端段() 和 N 端段() ，并在 C 端段的 N 端接上一个 16 转录因子，此时它并不能激活基因转录（由于它被限制在了 C 端段上，不能进入细胞核发挥作用） ；将该 C 端段连到一个膜蛋白上，将 N 端段连接到另一个膜蛋白上；如两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白的 N 端段和 C 端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白；此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降解，那么连接 C 端段的 16 转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达；酵母三杂交的原理与双杂交一样，只是它争论的是两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个成分使两个蛋白相互靠近；第三个成分可以是：蛋白，或小分子，如下图所示：如上图所示，在加入第三种成分前，蛋白 X 与蛋白 Y 之间并无直接相互作用，因此无法使和靠近，报告基因不能表达；当加入第三种成分后，蛋白 X 与蛋白 Y 的距离被拉近，和靠近，报告基因表达，从而可以被检测到；③ 技术（ ），即蛋白沉降技术，它是建立在蛋白质 亲和层析 的基础上的一种检测蛋白质间相互作用的分析方法；亲和层析的原理如下图所示，不同蛋白对配体的亲和程度不同，因此可以先将非特异结合的蛋白用低浓度缓冲液给清洗出去，只剩目的蛋白与层析柱结合，然后再用洗脱液将目的蛋白洗脱下来，达到纯化目的蛋白的作用；名师归纳总结——欢迎下载精品word学习资料可编辑技术利用的是亲和层析技术以及特异的配体（如或者镍） ；以下图为例，将的基因与蛋白 X 的基因融合，表达出融合蛋白；将该融合蛋白的溶液过带有配体的层析柱，那么这一融合蛋白就能结合在配体上，然后将待测蛋白的溶液过柱，并让其与融合蛋白反应一段时间；接着开头进行洗脱；假如待测蛋白与蛋白 X 无相互作用，那么在开头清洗的时候就会被洗下来；假如在用洗脱液洗脱后才能在收集到的样品中发觉待测蛋白（以及蛋白 X），说明待测蛋白与蛋白 X 可能有相互作用；|精.|品.|可.|编.|辑.|学.|习.|资.|料.④ （ ）是基于 进展而来，其原理如下图所示；将样品蛋白用 非变性的胶 分别，然后转膜，封闭，洗膜，加入待测蛋白，使其与已在膜上的样品蛋白进行相互作用；接着加入带有标记（如）的待测蛋白的抗体反应，最终进行显色（如加入的底物） ，观看试验结果；名师归纳总结——欢迎下载精品word学习资料可编辑名师归纳总结——欢迎下载精品word学习资料可编辑|精.|品.|可.|编.|辑.|学.|习.|资.|料.⑤ 免疫共沉淀（）（ ）免疫共沉淀是探测活体细胞内蛋白间的相互作用的一门技术； 它的原理是当细胞在非变 性条件下被裂解时， 完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来； 假如用蛋白 X 的抗体免疫沉淀 X，那么与 X 在体内有相互作用的蛋白 Y 也能沉淀下来；的原理如下图所示，第一从细胞中提取蛋白质，获得蛋白提取液，并将其与抗体孵育，使抗体与蛋白 X 结合；将预处理过的 G 琼脂糖珠（）加入到抗体与蛋白提取液的孵育液中反应，使抗体与 G 结合；通过离心将琼脂糖珠沉降到管底，去除上清液，然后再用缓冲液将琼脂糖珠冲洗数次，最终用 （或）进行检测；二，检测蛋白质与相互作用① （ ）的原理如下图所示；将的一个 3’端用 32 p 标记，然后将分成两份，一份直接用 Ⅰ进行不完全酶切；另一份先与待测蛋白混合反应一段时间，然后再用 Ⅰ进行不完全酶切；然后将两份样品用 变性 的胶进行电泳，观看电泳结果；下图中，由于待测蛋名师归纳总结——欢迎下载精品word学习资料可编辑白与结合的部位无法被 Ⅰ酶切降解，因此它的电泳结果中与直接用 Ⅰ进行处理的样品相比，会缺少一段；假如待测蛋白与无相互作用，那么这两组的电泳结果应当一样；名师归纳总结——欢迎下载精品word学习资料可编辑|精.|品.|可.|编.|辑.|学.|习.|资.|料.② （ ）， ，又称凝胶阻滞试验；其原理是与蛋白质结合的在胶（非变性胶）上比没有结合蛋白的移动速率要慢，因此通过电泳即可看到的变化，如下图所示；③ a （ ）该方法又成为原位选择法，用于检测文库中的蛋白与探针之间的相互作用；其原理和试验流程如下图所示，第一是用噬菌体（）侵染大肠杆菌，然后将这些大肠杆菌涂到平板上；接着进行转膜，将膜泡于水溶液中数小时，然后将该膜放于平板上，培养数小时（能诱导大肠杆菌表达文库蛋白） ；将膜取出，进行变性，复性和封闭（过夜） ，然后与放射性标记的探针进行反应， 最终洗膜，晾干并用胶片曝光；假如胶片上显现了条带，说明该文库蛋白与探针有相互作用；反之就说明两者无相互作用；名师归纳总结——欢迎下载。