生物光子学5-04教材.ppt

主讲人：刘立新lxliu@西安电子科技大学1第5章生物光子学成像技术25.1光学成像5.2光学显微技术5.3荧光显微技术5.4激光扫描共聚焦显微技术5.5多光子激发荧光显微技术5.6全内反射荧光显微技术5.7荧光共振能量转移成像技术5.8荧光寿命成像显微技术5.9光学相干层析成像技术5.10非线性光学成像技术5.11生物光子学成像技术的发展趋势本章内容3Ø荧光共振能量转移（FluorescenceResonanceEnergyTransfer，FRET）Ø工作原理：Ø一对合适的荧光物质（可以是不同分子或同一分子的不同生色团）可以构成一个能量供体(donor)和能量受体(acceptor)对，它们之间由于偶极--偶极的相互作用，激发供体分子的光子能量hν能够被传递至受体分子，而后受体分子通过发射出光子hν′(hνhν′)而松弛，这个过程就是荧光共振能量转移Ø以供体的激发光激发，供体产生的荧光强度比它单独存在时要低得多，而受体发射的荧光却大大增强，同时伴随供体的荧光寿命的相应缩短和受体的荧光寿命的相应拉长5.7荧光共振能量转移成像技术4ØFRET发生条件：1）供体和受体之间达到合适的距离内(1～10nm)，能量转移效率和分子之间距离的六次方成反比关系；2）供体与受体的跃迁偶极有一定的相对取向；3）供体的发射光谱与受体的吸收光谱有相当程度的重叠。

ØFRET成像是生物医学研究的重要手段之一它应用于蛋白质-蛋白质间相互作用，钙新陈代谢、蛋白酶活性、和高吞吐量放映化验等研究5.7荧光共振能量转移成像技术5CFPYFPFRET能级图级图5.7荧光共振能量转移成像技术CFP受光激发发后便发发射光；CFP离YFP的距离大于10nm；YFP没有受到激发发，因此也不发发射光CFP受光激发发后但没有发发射光；CFP与YFP的距离非常接近（1-10nm）；YFP没有受到激发发，但发发射光6(供体）(受体）(效率）5.7荧光共振能量转移成像技术7已知的FRET对对：染料类类：FITCRhodamine、Alexa488Cy3、Cy3Cy5、FITCCy3荧荧光蛋白类类：CFPYFP、BFPGFP、BFPYFP、CFPDsRED、GFPDsRED混用：GFPRhodamine75.7荧光共振能量转移成像技术885.7荧光共振能量转移成像技术9910FLIM-FRETFrom:PhizickyEBastiaensPIHZhuHSnyderMFieldsS.“Proteinanalysisonaproteomicscale”Nature422208-2152003Figure3:Principleofopticaldetectionofproteinpost-translationalmodificationsonacellmicroarray10•FRET目前应用的几个热点：–FRET技术及其应用向亚细胞及单分子观测水平发展–信号转导通道（网络）的亚细胞水平定位–生理事件过程中信号转导过程的细节、以及调控过程的时空关系–利用FRET技术追踪在体水平生命过程5.7荧光共振能量转移成像技术11115.1光学成像5.2光学显微技术5.3荧光显微技术5.4激光扫描共聚焦显微技术5.5多光子激发荧光显微技术5.6全内反射荧光显微技术5.7荧光共振能量转移成像技术5.8荧光寿命成像显微技术5.9光学相干层析成像技术5.10非线性光学成像技术5.11生物光子学成像技术的发展趋势本章内容12•荧荧光寿命是指分子受到光脉冲激发发后返回基态态之前在激发态发态平均停留的时间时间，定义为荧义为荧光强度衰减到初始值值的1e(37%)时时所需要的时间时间，通常小于100ns。

•通过扫过扫描测测量样样品不同位置处处的荧荧光寿命成像，能够够反映组织组织微环环境，如分子所处处微环环境中的许许多生物物理、生物化学参数如pH值值、离子浓浓度(如Ca+、K+等)、氧压压、溶液疏水性及猝灭剂灭剂(如碘化物、丙烯酰烯酰胺)等的分布5.8荧光寿命成像显微技术Exponentialdecayoffluorescence13荧光寿命成像显微技术（FluorescenceLifetimeImagingMicroscopyFLIM）的特点：①荧光寿命对荧光分子局部环境高度敏感；•荧光寿命不受荧光强度、染料浓度的影响，并且最大程度上与荧光剂的光致漂白无关；•尽管某些荧光团的荧光谱相似，但在不同的环境下其寿命不同，因此寿命是更加敏感的环境参量；•由于供体能量转移到受体上，因此只需要测量供体的荧光寿命，就可以测量其能量转移（FRET）5.8荧光寿命成像显微技术1414PhotochemPhotobiolSci413-222005利用荧光寿命能够测量利用荧光寿命能够测量……折射率，pH，Ca2+浓度等长寿命-无FRET短寿命-有FRET分子的旋转动力学5.8荧光寿命成像显微技术15155.8荧光寿命成像显微技术1616外部因素则包含多方面，主要有：①光照射是致荧光淬灭的最常见原因，；②荧光物质的分子与外部分子(或离子)形成非荧光的化合物；③共振能量的转移；④溶剂种类、pH值及温度等环境条件。

荧光淬灭是指荧光分子由内部因素和外部因素同时作用造成的不可逆破坏内部因素主要是分子从激发态回到基态以非辐射跃迁形式释放能量Quenching&BleachingPhilippeI.H.BastiaensandAnthonySquire.trendsinCELLBIOLOGY(Vol.9)February1999=(m+p)2p=phaseoffluorescencem=modulationdepthoffluorescence荧光寿命测量：时域和频域5.8荧光寿命成像显微技术1717FLIM实现方法=(m+ω)2ω=phaseoffluorescencem=modulationdepthoffluorescence5.8荧光寿命成像显微技术Time(ns)IExcitationEmissionω=2πƒabAB调制激发和发射光的直流成分分别为A和B；调制振幅分别为a和b；发射光相对于激发光的相位延迟为φ，解调系数为M相位寿命：调制寿命：调调制频频率f，ω=2πf5.8荧光寿命成像显微技术频域法测量荧光寿命原理图=(M+φ)219•荧光寿命的时域测量方法：–门控像增强器（Gatedimageintensifier）–时间相关单光子计数器（TimeCorrelatedSinglePhotonCounting，TCSPC）–扫描相机（Streakcamera）5.8荧光寿命成像显微技术2020•Gatedimageintensifier基于门控像增强器的FLIM5.8荧光寿命成像显微技术2121fromW.Becker著，屈军乐译，高级时间相关单光子计数技术，科学出版社，2009TCSPC测测量寿命5.8荧光寿命成像显微技术2222TCSPCPrinciplefromW.Becker著，屈军乐译，高级时间相关单光子计数技术，科学出版社，20095.8荧光寿命成像显微技术23235.8荧光寿命成像显微技术24时间相关单光子计数法装置示意图24SampleTCSPCCardFluorescenceDecayAnalysisTi:SapphireLaserDichroicFluorescenceLifetimeImageEmissionFilterDetectionMCP-PMTScannerLeicaTCSSP2Becker&HicklSPC150利用TCSPC技术术的共焦FLIM技术术5.8荧光寿命成像显微技术2525深大光电电工程学院TCSPC-FLIM系统统5.8荧光寿命成像显微技术2626扫描相机工作原理5.8荧光寿命成像显微技术2727X(position)Y(time)0ns5ns•基于扫扫描相机的FLIM:Streak-FLIMofHamamatsuFLIMopticsStreakCamera5.8荧光寿命成像显微技术2828基于扫扫描相机的FLIM:STSR-MMM5.8荧光寿命成像显微技术2929基于扫扫描相机的FLIM:STSR-MMMofSZUScanopticsStreakcamera5.8荧光寿命成像显微技术3030用双光子FLIM测量氯离子浓度FLIMFLIM的应用的应用5.8荧光寿命成像显微技术3131FLIM的应用-区分有相互作用和没有相互作用的蛋白分子5.8荧光寿命成像显微技术3232FLIM的应用-研究蛋白分子之间的相互作用5.8荧光寿命成像显微技术3333FLIM的应应用-测测量组织组织中的pH5.8荧光寿命成像显微技术3434FLIM的应应用-AMD的检测检测及诊诊断5.8荧光寿命成像显微技术35355.1光学成像5.2光学显微技术5.3荧光显微技术5.4激光扫描共聚焦显微技术5.5多光子激发荧光显微技术5.6全内反射荧光显微技术5.7荧光共振能量转移成像技术5.8荧光寿命成像显微技术5.9光学相干层析成像技术5.10非线性光学成像技术5.11生物光子学成像技术的发展趋势本章内容36•X-ray成像•磁共振成像•计算层析CT•超声成像光学成像技术有损伤分辨力100m系统庞大价格昂贵无损伤分辨力1增益：5.9光学相干层析成像技术4747数据采集与处理在光电探测器输出电信号的处理上，要经过以下几个步骤：首先要经过带通滤波器将直流和高频光强滤除，只允许外差调制信号通过；然后再进行信号包络检测（解调：低通或锁相放大）；最后利用高速数字采集系统将模拟电信号转换成数字信号，并传输到计算机系统进行图像重建和显示。

5.9光学相干层析成像技术4848光纤纤式OCT5.9光学相干层析成像技术4950:50光纤纤耦合器光纤OCT的特点:•灵活性•可携带•易于集成到其他医学成像仪器，例如：内窥镜49•OCT的优势优势–分辨率高：OCT图像轴向分辨率和横向分辨率互不相关，能提供独立于横向分辨率的近似于微米量级的轴向分辨率–高灵敏度：由于引入了外差探测，其探测灵敏度远远高于直接探测典型的OCT系统可达到90dB~100dB的探测灵敏度，能够探测来自高散射生物组织2~3mm深度的光学信号–实时成像–结构简单、成本低廉：OCT成像装置的核心是迈克尔逊干涉仪，成像原理简单，制造成本相对较低，各种光学器件和检测设备易于在市场中购买–与导管和内窥镜兼容：基于光纤的设计可以使OCT系统直接和导管或者内窥镜结合起来•OCT的缺点：–分辨率低于双光子荧光或共聚焦显微镜5.9光学相干层析成像技术5050OCT在医学诊断领域的主要应用OCT技术在眼科疾病、牙科疾病、心血管疾病、内腔肠胃道疾病、皮肤癌的早期诊断以及胚胎发育生物学等研究中，都具有重要的应用价值：Ø眼科检查Ø皮肤烧伤检查Ø内腔活检5.9光学相干层析成像技术51眼科检查：利用OCT技术，可用于眼底视网膜在微观解剖结构上病变的检测，也可用于眼前部角膜、虹膜、晶状体等组织的检测或参数测量。

它是青光眼、糖尿病水肿等视网膜疾病早期诊断的有效工具SLD20nmFWHMUltrabroadspectraenablemicrometerresolutionFemtosource:100nmFWHM5.9光学相干层析成像技术52视网膜中心凹囊肿黄斑裂孔视网膜神经上皮层变薄黄斑水肿视网膜脱离5.9光学相干层析成像技术5353黄斑裂孔的不同阶段5.9光学相干层析成像技术5454皮肤烧伤检查：烧伤组织与正常组织的具有不同的光学各向异性特征，采用偏振敏感的OCT成像，可以检测组织表层的烧伤程度5.9光学相干层析成像技术55内腔活检：OCT结合内窥镜，可以将检测范围拓宽到体腔内部的呼吸道、消化道、泌尿系统以及心血管系统等，实施活体无损的高分辨率截面成像心脏血管5.9光学相干层析成像技术56OCT还可以在制药、工业测量等领域中得到应用感光性树脂5.9光学相干层析成像技术57Quiz41.什么是FRET？FRET可以测测量两个分子之间。